摘要：二氧化氯是一種安全、高效的食品和飲用水消毒劑。二氧化氯通過氧化酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等氨基酸使蛋白質(zhì)變，本文綜述了二氧化氯與重要生物分子的作用以及二氧化氯在個體水平上對微生物的致死靶點等方面的研究進展，并指出二氧化氯的殺菌機理目前仍然存在較大的爭議。
關鍵詞：二氧化氯；作用機理；氨基酸；DNA；RNA；細胞膜
二氧化氯是一種安全高效的氧化型消毒劑，其氧化能力是氯氣的2.5倍[1]。因其不與有機物發(fā)生取代反應而避免了產(chǎn)生三氯甲烷等致癌、致畸、致突變副產(chǎn)物，被視為傳統(tǒng)氯消毒劑的換代產(chǎn)品[2]。目前已被應用的領域有飲用水和食品生產(chǎn)消毒[3,4]、醫(yī)療器械消毒[5]、藻類控制[6]、室內(nèi)污染的消除和公共衛(wèi)生控制等[7,8]。相對于二氧化氯的應用而言，對其作用機理的研究比較滯后。上世紀60年代以來，國內(nèi)外的一些研究者分別以核酸、蛋白質(zhì)、細菌、病毒和酵母菌等為材料研究了二氧化氯的殺菌機制。本文就二氧化氯殺菌機理方面的研究進展做一綜述，以期更全面、深刻理解二氧化氯的作用實質(zhì)，更有效地開發(fā)和利用這種優(yōu)質(zhì)消毒劑。
1 二氧化氯對重要生物分子的作用機制
在分子水平上闡明二氧化氯對生物大分子的作用機制是人們解釋其殺菌機理的前提，也是科研人員一直以來的努力方向。作為一種非特異性的氧化型消毒劑，二氧化氯對微生物的致死靶點至今仍然存在很大爭議。因此，擴大研究對象，闡明與細胞成分及生化過程相關的
一些重要的生物大分子與二氧化氯的反應機制對于全面、深刻理解二氧化氯殺菌機理具有重要意義。目前已從化學、物理等角度研究氨基酸、谷胱甘肽、還原型輔酶Ⅰ（NADH）、胞嘧啶、脫氧核苷三磷酸等重要分子在體外與二氧化氯作用的機制。
1.1二氧化氯與重要生物分子的作用途徑
1.1.1對二氧化氯敏感的氨基酸和蛋白質(zhì)
至今為止人們發(fā)現(xiàn)二氧化氯只和幾種還原性的氨基酸發(fā)生反應。早在1967年Benarde等利用OD280的變化以及紙層析法均未能證明二氧化氯與蛋白質(zhì)和游離氨基酸（組氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸和亮氨酸）發(fā)生反應[9]。但Noss等在離體條件下將二氧化氯分別與19種氨基酸混合，發(fā)現(xiàn)有6種氨基酸表現(xiàn)出了與二氧化氯的反應活性（以二氧化氯消耗量表示），分別是脯氨酸、組氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸和蛋氨酸。其中半胱氨酸、色氨酸和酪氨酸的反應速度最快，其它三種反應速度太慢而似乎與微生物失活無關。即便是前三種敏感氨基酸，它們在天然和變性的病毒顆粒中與二氧化氯的反應活性差別很大。在f2病毒顆粒中，色氨酸和半胱氨酸被包埋在蛋白質(zhì)結構的內(nèi)部而難于與二氧化氯反應，而酪氨酸因為有一部分暴露在蛋白表面可被二氧化氯氧化。當病毒外殼蛋白被變性處理后半胱氨酸和色氨酸與二氧化氯的反應活性則顯著提高[10]。
Ogata利用牛血清白蛋白（BSA）和釀酒酵母的6-磷酸葡萄糖脫氫酶為模型的研究進一步證實了二氧化氯對酶活性的破壞。10μmol/L的二氧化氯在15s內(nèi)就能使6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性下降90%。研究發(fā)現(xiàn)被二氧化氯氧化的蛋白質(zhì)α-螺旋的數(shù)量減少并且整合有來自二氧化氯的氧原子，確認了二氧化氯對色氨酸和酪氨酸的共價氧化，并且用質(zhì)譜法分析了氧化的產(chǎn)物[11]。Ogata的研究在氨基酸水平上解釋了蛋白質(zhì)失活的機制，也證明了二氧化氯與蛋白質(zhì)不發(fā)生涉及氯原子的取代反應。
迄今為止，以游離氨基酸、純化蛋白、變性的病毒蛋白等材料開展的離體研究對于人們了解二氧化氯對生物細胞的氧化機制有很大幫助，但是由于敏感氨基酸在細胞的各個組分中廣泛分布，因此二氧化氯對這些氨基酸的損傷并沒有結構和酶的特異性，上述研究結果還難以解釋二氧化氯在生理層面上發(fā)生損傷的順序及其與細菌致死的關聯(lián)度。
1.1.2二氧化氯對DNA分子反應活性
作為遺傳信息的載體，DNA在細胞物質(zhì)的合成和遺傳過程中具有重要作用。由于受到技術手段的限制，人們曾認為二氧化氯對DNA的損傷不明顯[9]，但近年來的研究證明二氧化氯對DNA有實質(zhì)的損傷作用。Napolitano等描述了二氧化氯與鳥苷一磷酸（5′-GMP的反應歷程：鳥苷陰離子和二氧化氯反應生成鳥苷自由基，該自由基與第二個二氧化氯分子反應
生成加合物guanosyl-OClO，最終分解成咪唑啉酮和一氯咪唑啉酮[12]。韋明肯等發(fā)現(xiàn)75 mmol/L的二氧化氯使脫氧核糖核苷三磷酸混合物（dNTPs）的OD260下降54.23%以上，推測可能與嘧啶堿和嘌呤堿的共軛雙鍵被破壞有關[13]，這與Napolitano報道的二氧化氯對5′-GMP的作用發(fā)生在鳥苷基團部分相一致。在DNA水平上，二氧化氯作用后的質(zhì)粒作為聚合酶鏈式反應（PCR）模板的活性以及轉化大腸桿菌的效率均有明顯下降[13]。韋明肯的研究在物理特性和生理功能水平上支持了二氧化氯對DNA損傷的判斷，但由于對DNA的損傷是在遠高于正常消毒濃度時才比較明顯，因此DNA損傷在殺菌作用中不是關鍵因素。
1.1.3二氧化氯與重要生物分子的反應途徑
二氧化氯與生物分子之間的反應途徑有助于人們了解其殺菌的化學本質(zhì)。一系列的研究表明，二氧化氯與酶和氨基酸的作用伴隨有二氧化氯加合物（C(H)-OClO）的生成。初始底物（氨基酸）一般先與第一個二氧化氯分子發(fā)生僅涉及單電子轉移的氧化反應，形成的中間產(chǎn)物接著與第二個二氧化氯分子發(fā)生氧化反應，生成的二氧化氯加合物經(jīng)過一系列后續(xù)反應最后生成終產(chǎn)物。
色氨酸與第一個二氧化氯分子的反應產(chǎn)生了色氨酰自由基陽離子，接著去質(zhì)子化形成中性的色氨酰基，并馬上與第二個二氧化氯分子反應，生成一個短暫存在的以C(H)-OClO鍵連接的二氧化氯加合物，此加合物在一個涉及3電子的氧化反應中衰減生成次氯酸、N-甲酰犬尿氨酸（N-formylkynurenine， NFK）和其它產(chǎn)物[14]，終產(chǎn)物的種類與Ogata的報道相一致[11]。在二氧化氯與半胱氨酸（CSH）的反應中，可能的反應機制是一個電子從半胱氨酸轉移到二氧化氯分子上，然后氧化型的半胱氨酸正離子基團（CS）與第二個二氧化氯分子反應，形成半胱氨酸-ClO2加合物（CSOClO）[15]。酪氨酸與二氧化氯反應產(chǎn)生的酚氧自由基快速地結合下一個二氧化氯分子，形成帶有C(H)OClO鍵的短暫存在的加合物，然后迅速衰減生成多巴醌[16]。NADH則首先轉移一個電子到二氧化氯分子，然后傳遞一個H給H2O，最后又轉移一個電子給第二個二氧化氯分子，形成的產(chǎn)物包括兩個ClO2?, 一個H3O+和一個NAD+[17]。上述研究報道顯示形成二氧化氯加合物是二氧化氯氧化反應的一個共性特征。
1.2pH值對二氧化氯與生物大分子作用的影響
pH值對二氧化氯的殺菌效果有明顯影響。在pH6-9的范圍內(nèi)，pH值越高，殺菌效果越好，二氧化氯在pH8.0時對隱孢子蟲卵的殺滅效率是pH6.0溶液的2倍[18]。這種殺菌效果的差異與不同酸堿度下二氧化氯的反應途徑和速度不同有關。pH值影響著二氧化氯與色氨酸的反應級數(shù)：在pH＜5 時二氧化氯的反應為二級反應；pH＞5.0時，則呈一級反應[15]。在低pH值的條件下，二氧化氯與半胱氨酸的反應摩爾比是6:5，而在高pH值的條件下，反應摩爾比是2：10，因此在高pH值下氧化半胱氨酸的效率更高。在pH6.7時，二氧化氯與半胱氨酸的反應速度比與胱氨酸的快7個數(shù)量級[15]。在pH4-7的范圍內(nèi)，二氧化氯對酪氨酸的氧化反應速度隨著pH值的增高而顯著增大，并產(chǎn)生一系列的氧化產(chǎn)物[16]。了解pH值與二氧化氯氧化作用的影響可糾正國內(nèi)部分人關于二氧化氯殺菌效果不受pH值影響的觀點，有利于人們在實踐過程中遵循規(guī)律，最大限度發(fā)揮其殺菌效用，。
2 二氧化氯對微生物個體水平的殺滅機理
二氧化氯對一些重要生物分子的作用機制為人們深入理解二氧化氯的殺菌機理奠定了理論基礎。但是對于二氧化氯這種非特異性氧化型消毒劑而言，如何以離體的分子損傷事件解釋具體的生理功能損傷，特別是找到細菌致死的首要靶標，并不是一件容易的事情。目前，以細菌、病毒和真菌為對象的二氧化氯殺菌機理研究均有報道，但其殺菌的致命靶點仍然存在很大爭議。
2.1二氧化氯對細菌作用機理研究進展
2.1.1二氧化氯對細菌細胞屏障及其生理功能的損傷
傳統(tǒng)的氯消毒劑（Cl2、NaClO等）對細菌的形態(tài)和結構均有比較明顯的損傷，與此不同的是二氧化氯對細胞形態(tài)結構的破壞不明顯[19-22]，因此二氧化氯不是通過破壞細胞形態(tài)結構的方式殺滅細胞。即使形態(tài)結構保持完整，但是二氧化氯的作用會造成膜的通透性增加，細胞內(nèi)鉀離子、鎂離子和ATP等小分子物質(zhì)大量泄漏[19,22]。值得注意的是，即使很高的二氧化氯濃度也不會造成細菌的DNA和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的大量漏出[9,23,24]。 Benarde用0.25mg/ml的二氧化氯作用于大腸桿菌5分鐘，上清液在260nm和280nm處均沒有吸收峰出現(xiàn)[9]；劉雪林以3H-TdR同位素示蹤顯示細菌的殺滅率達到97%以上時，DNA的漏出率幾乎為零[21]。蛋白質(zhì)的泄漏則不僅總量偏少，而且隨著二氧化氯濃度的增高胞內(nèi)蛋白泄漏量反而呈下降趨勢，推測可能是高濃度的二氧化氯使細胞膜上的通道收縮所致[24]。雖然這些研究者都發(fā)現(xiàn)了小分子物質(zhì)泄漏現(xiàn)象，但因為同時還伴隨有酶失活等其它的損傷事件，所以認定小分子物質(zhì)泄漏為細菌致死原因也難令人信服。
由于細菌沒有細胞器，很多酶系分布在細胞膜上，膜的損傷不但表現(xiàn)為通透性增加，還伴隨有酶的失活和生理功能的喪失。Berg 等對大腸桿菌的研究顯示，二氧化氯造成大量的鉀離子泄漏的同時，細胞呼吸被明顯抑制，但在亞致死濃度下就出現(xiàn)了呼吸抑制現(xiàn)象，因此認為呼吸抑制對于細菌致死不如鉀離子泄漏那么重要[19]。我們的研究發(fā)現(xiàn)二氧化氯作用的白色念珠菌細胞的內(nèi)外結構保持完整，但是胞內(nèi)的鉀離子和ATP大量泄漏，細胞質(zhì)膜電位消失并與死亡率有很高的對應性，提示雖然細胞膜沒有明顯的物理損傷，但是生理功能遭到嚴重破壞[23]。以原核生物為材料研究細胞膜損傷與殺菌的關系存在的一個缺陷是膜損傷和膜系酶損傷交織在一起而無法區(qū)分，如果以真核生物為材料則可有效避免此類問題。我們選用真核微生物白色念珠菌作為材料的研究表明抑制確實與死亡不同步，呼吸抑制率在不同的時間點始終低于菌體死亡率，并且厭氧和好氧條件下死亡率沒有顯著差異[25]，有力支持了之前Berg關于呼吸抑制不是二氧化氯殺菌首要靶點的判斷。
二氧化氯對細菌生理的損傷還包括蛋白質(zhì)合成抑制和酶失活。Benarde分別用14C標記的苯丙氨酸和纈氨酸摻入法，觀察到了明顯的蛋白質(zhì)合成受阻現(xiàn)象，他推測是二氧化氯破壞了核糖體的結構，使之失去合成蛋白質(zhì)的功能而致細菌死亡[9]。但Roller等以血友流感細菌（Haemophilus influenzae）作為材料的研究結果則顯示總脫氫酶的活力被完全抑制時仍有部分細菌存活，最小致死濃度下蛋白質(zhì)合成也只是部分被抑制，因此推測二氧化氯對細菌的致命靶點不是脫氫酶、也不是蛋白質(zhì)合成，而是在其它方面[26]。劉雪林發(fā)現(xiàn)ATP酶的破壞和脂質(zhì)過氧化物丙二醛的產(chǎn)量隨著細菌死亡率的上升而增加，使人們對二氧化氯的細胞損傷作用的理解得到了延伸[27]。
2.1.2二氧化氯對DNA的損傷
Young等研究了枯草芽胞桿菌芽胞被二氧化氯作用的機理。野生型芽胞內(nèi)具有α型及β型小分子酸性可溶DNA保護蛋白，研究表明這兩種保護蛋白的的缺失突變體（α-β-）對二氧化氯的敏感性與野生型比沒有明顯差異。芽胞外殼是抵抗二氧化氯的主要屏障，二氧化氯可能是通過破壞芽胞內(nèi)膜而使細胞使死亡[28]。韋明肯等的研究表明，只有很高濃度的二氧化氯才對離體質(zhì)粒的PCR反應模板活性和轉化大腸桿菌的效率產(chǎn)生顯著影響，這或許也說明了對DNA的損傷可能不是殺滅細菌的主要靶標[13]。釀酒酵母D7雙倍體菌株的試驗發(fā)現(xiàn)僅在二氧化氯為5-10倍于實際水處理濃度的時才表現(xiàn)出對酵母的基因毒性[29]。
總之，目前在二氧化氯對細菌的致死靶點上難以得出排他性的結論，但相比之下，DNA對細菌致死的相關性比蛋白失活和膜通透性及膜電位的損傷要低。
2.2二氧化氯對病毒作用機理研究進展
研究者對于核酸和衣殼何者是二氧化氯致死靶點一直存在爭議。二氧化氯與氯氣的顯著不同在于，氯氣會使脊髓灰質(zhì)炎病毒的超顯微結構發(fā)生變化，而二氧化氯則在沒有造成形態(tài)損傷的情況下將該病毒殺滅[18]。目前已有研究證明了二氧化氯對病毒RNA有降解和抑制合成的作用。Alvarez等發(fā)現(xiàn)被碘和二氧化氯氧化的病毒外殼蛋白的等電點均從7.0下降到5.8，所不同的是被二氧化氯滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒仍然能夠正常吸附、穿透寄主細胞并起始脫殼作用，而碘滅活的病毒則失去了對宿主的吸附能力；另一方面，[14C]尿嘧啶示蹤的RNA合成量明顯下降，因此推測二氧化氯是通過破壞病毒RNA使其喪失模板功能，阻斷了新RNA合成而使病毒失活[30]。Li等用ELISA、長距離步移RT-PCR法研究了二氧化氯殺滅甲肝病毒的機理，發(fā)現(xiàn)失活病毒基因組的5`端非編碼區(qū)一個600堿基的RNA片段有缺失[31]。由于二氧化氯作用后甲肝病毒的滅活與其RNA5‵端非編碼區(qū)的破壞相一致，李君文等認為可以用PCR法來檢測甲肝病毒的滅活效果[32]。Simonet發(fā)現(xiàn)二氧化氯對病毒RNA的降解與對病毒顆粒的滅活均表現(xiàn)出濃度依賴性。二氧化氯對降解脊髓灰質(zhì)炎病毒5′-UTR and 3′-UTR 末端的非翻譯區(qū)具有偏好性 [33]。奇怪的是，二氧化氯對病毒DNA的損傷作用目前未見報道。
也有一些研究者認為蛋白質(zhì)衣殼是二氧化氯的殺菌靶點。Noss也認為酪氨酸被氧化是噬菌體f2失活的主要原因，因為在二氧化氯作用下，酪氨酸殘基的下降曲線和病毒活力的下降曲線趨勢一致，雖然前者的速度要比后者慢得多[10]。 Hauchman 等發(fā)現(xiàn)f2噬菌體被二氧化氯滅活以后失去了對宿主的侵染力，但核酸仍然具有活性，由此推測病毒失活可能是因為蛋白質(zhì)衣殼被破壞引起[34]。
3 總結和展望
目前二氧化氯在氨基酸水平上的作用靶點和氧化機制有了比較明確的認識，但是在生理結構和功能水平上至今仍然存在著很大的爭議。只有將分子損傷放到結構與功能損傷的層面并與微生物的殺滅率相聯(lián)系，才能比較全面地闡述二氧化氯的殺菌機理。
不同研究者對二氧化氯作用機理的研究結果不盡相同甚至得出互相矛盾的結論，可能與所選擇的生物材料不同（不同的病毒或細菌種類）以及研究角度、檢測方法、實驗設備及條件不同有關。比如對核酸的損傷研究中，對于DNA的損傷主要以細菌為材料展開研究，而對于RNA的損傷主要以病毒為材料開展研究。目前未見有關于二氧化氯對病毒DNA或者對細菌RNA的損傷報道，也許二氧化氯對病毒和細菌的作用機制不同，對RNA病毒和DNA病毒的作用機制也不同。這都需要進一步擴大微生物材料的種類才能得出更全面、準確的結論。另外，人們不應該過度受到抗生素（具有明確靶點）作用機理研究思維的束縛，而是抓住其“非特異性氧化”的特征，從二氧化氯與微生物接觸以及進入細胞的時空順序特點出發(fā)來尋找致死靶點，或許會有新的突破。
聯(lián)系客服
