miR-644a作為一個(gè)較新的miRNA，從PubMed上也只搜索到了三篇相關(guān)的文獻(xiàn)，最早報(bào)道是源于2012年P(guān)los One。前天的一篇miR-644a很多人覺(jué)得發(fā)得比較虧，有人覺(jué)得可以發(fā)到Cancer Research上。
今天我們就來(lái)看一篇Clin Cancer Res上的miR-644a。
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PITX2是Wnt通路下游效應(yīng)分子，能激活細(xì)胞增殖、生存的靶標(biāo)基因的表達(dá)。
miR-644a在腫瘤組織中低表達(dá)，該miR-644a能減弱ESCC的惡性程度、抑制干細(xì)胞特性。它與PITX2呈表達(dá)負(fù)相關(guān)。通過(guò)下調(diào)miR-644a能直接上調(diào)PITX2從而激活Akt/GSK-3β/β-catenin通路，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性。另外啟動(dòng)子的超甲基化作用是ESCC下調(diào)miR-644a表達(dá)的主要原因。
看一下主要思路，太長(zhǎng)不看版看標(biāo)題：
1、首先，依然是找目標(biāo)分子，找關(guān)系
作者通過(guò)miRANDA預(yù)測(cè)軟件，結(jié)合NCBI/GEO/GSE23142前期報(bào)道在ESCC下調(diào)的miRNAs，取交集發(fā)現(xiàn)了miRNA-644a。
PITX2作為Wnt通路下游效應(yīng)分子，能激活細(xì)胞增殖生存的靶標(biāo)基因的表達(dá)。下面就開(kāi)始驗(yàn)證miR-644a與PITX2作用關(guān)系。
a、miR-644a在腫瘤組織與腫瘤細(xì)胞中下調(diào)的。b、在PITX2高表達(dá)的樣本或細(xì)胞中miR-644a是低表達(dá)的。確定了兩者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
與臨床結(jié)合，miR-644a與PITX2與預(yù)后相關(guān)。miR-644a表達(dá)越低，ESCC病人手術(shù)后越容易發(fā)生復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。相反，高表達(dá)miR-644a病人預(yù)后較好。
2、miR-644a體外及體內(nèi)的功能研究
PITX2的mRNA存在一個(gè)與miR-644a種子域互補(bǔ)的序列。且驗(yàn)證了，它們之間就是通過(guò)這個(gè)區(qū)域結(jié)合。
還是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證miR-644a對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移、侵襲作用的影響。
接著是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。首先miR-644a能抑制腫瘤生成，其次H&E染色發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出分叉狀生成形式，并擴(kuò)散到周邊組織。而過(guò)表達(dá)miR-644a的腫瘤細(xì)胞呈圓滑狀，無(wú)侵潤(rùn)狀態(tài)。
3、機(jī)制研究。
依然從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)引出：共過(guò)表達(dá)miR-644a、PITX2引發(fā)抑制細(xì)胞的增殖、克隆形成、侵襲與轉(zhuǎn)移作用。但這種作用沒(méi)有單純過(guò)表達(dá)miR-644a效果來(lái)得高。反向驗(yàn)證沉默PITX2也能引起上述作用。這部分內(nèi)容驗(yàn)證了第一部分內(nèi)容。
這里如果再加一個(gè)干擾掉過(guò)表達(dá)miR-644a細(xì)胞中PITX2，確認(rèn)細(xì)胞的表型，才能更加說(shuō)明問(wèn)題：miR-644a通過(guò)PITX2起作用。
那么這種調(diào)控作用的關(guān)系是什么樣的呢？
前期報(bào)道，PITX2關(guān)聯(lián)Wnt/β-catenin通路。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-644a的ESCC細(xì)胞中，β-catenin及相關(guān)下游基因的表達(dá)顯著下降。同時(shí)顯示出β-catenin胞漿與胞核中重分配（定位胞漿。而Wnt經(jīng)典通路中，β-catenin定位于胞核，促進(jìn)基因表達(dá)），這里說(shuō)明miR-644a調(diào)控了Wnt/β-catenin。
另外，β-catenin與下游基因Lef-1 、c-myc啟動(dòng)子區(qū)TCF位點(diǎn)結(jié)合減低（TCF參與Wnt/β-catenin通路）。
另外，作者通過(guò)TOP/FOP flash熒光實(shí)驗(yàn)（測(cè)定細(xì)胞內(nèi)beta-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性的方法）發(fā)現(xiàn)報(bào)告基因的表達(dá)受到miR-644a抑制，表明miR-644a抑制β-catenin轉(zhuǎn)錄。
這部分內(nèi)容說(shuō)明，miR-644a通過(guò)抑制PITX2表達(dá)，來(lái)阻遏激活Wnt/β-catenin通路。
4、體外體內(nèi)細(xì)胞干性相關(guān)實(shí)驗(yàn)-Wnt/β-catenin通路
激活Wnt/β-catenin通路被認(rèn)為是導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦杉?xì)胞樣特征的主要原因，而且這種干細(xì)胞樣特別對(duì)腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移起到作用。上述第三部分內(nèi)容已經(jīng)證實(shí)，miR-644a能阻遏Wnt/β-catenin通路，所以，作者猜測(cè)miR-644a是否能抑制細(xì)胞獲得干細(xì)胞樣特征。
過(guò)表達(dá)miR-644a后檢測(cè)多種細(xì)胞干性相應(yīng)的分子，發(fā)現(xiàn)這些分子的表達(dá)都降低了。且細(xì)胞呈更小更少的球狀，并對(duì)化療藥物敏感！并且干擾PITX2也能起到相同作用。
5、細(xì)胞侵潤(rùn)，成球能力-Akt/GSK-3β/β-catenin通路
前期報(bào)道Akt激活抑制GSK-3β，隨后激活Wnt/β-catenin通路。
作者通過(guò)過(guò)表達(dá)miR-644a，檢測(cè)細(xì)胞中PITX2, p-Akt, p-GSK-3β (非激活態(tài)) ，active-β-catenin表達(dá)下調(diào)。并且通過(guò)rescue實(shí)驗(yàn)，將PITX2轉(zhuǎn)染到過(guò)表達(dá)miR-644a中，能恢復(fù)上述蛋白的表達(dá)。這表明miR-644a通過(guò)PITX2來(lái)抑制Akt/GSK-3β/β-catenin通路。
并且在組織樣本中也驗(yàn)證了miR-644a與PITX2, p-Akt, p-GSK-3β 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
這邊作者做一個(gè)乙?；{(diào)控實(shí)驗(yàn)：已知Akt賴氨酸乙?；{(diào)控其磷酸化和激活作用，隨后調(diào)控下游效應(yīng)分子。作者想了解一下miR-644a是否參與Akt， GSK-3β ， β-catenin乙?；饔?。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-644a能顯著提升Akt乙?；?，另外過(guò)表達(dá)PITX2則能抑制這種作用。這表明在ESCC中，miR-644a抑制PITX2調(diào)控Akt乙酰化。
6、上面的研究圍繞著miR-644a參與調(diào)控作用而設(shè)計(jì)的。事實(shí)上，在腫瘤組織中miR-644a是低表達(dá)的。而這種下調(diào)作用的原因，才是連接臨床治療的關(guān)鍵。
miR-644a是ITCH基因內(nèi)含子編碼，其在ESCC中的表達(dá)與ITCH的mRNA表達(dá)水平相關(guān)。通過(guò)UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)分析ITCH啟動(dòng)子區(qū)，其CpG島位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-285 bp 至 -56 bp區(qū)。隨后BGS(重亞硫酸鹽基因組測(cè)序)PCR（啟動(dòng)子甲基化分析），發(fā)現(xiàn)在miR-644a低表達(dá)的ESCC細(xì)胞株與樣本中，ITCH啟動(dòng)子區(qū)（與miR-644a共表達(dá)）超甲基化。隨后，使用甲基化抑制劑處理低表達(dá)miR-644a細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)能恢復(fù)miR-644a的表達(dá)。這表明，ESCC中miR-644a低表達(dá)歸咎于其啟動(dòng)子超甲基化。
總結(jié)一下：找分子，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（表型），動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（表型驗(yàn)證），有表型了扯通路及明星分子，找機(jī)制。
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