人類實(shí)踐的體制，恐怕沒(méi)有一個(gè)是只有優(yōu)點(diǎn)、沒(méi)有缺點(diǎn)的。
近百年世界各國(guó)大學(xué)逐漸普及的教授預(yù)聘制，也是一樣。
有優(yōu)點(diǎn)，有缺點(diǎn)。
有適用的時(shí)間和空間范圍。
當(dāng)然，偽預(yù)聘制泛濫的時(shí)空，不是預(yù)聘制的問(wèn)題。打著預(yù)聘制旗號(hào)做完全相反于預(yù)聘制的實(shí)踐，更是一些習(xí)慣于欺騙的人和機(jī)構(gòu)的自身問(wèn)題。
但是，預(yù)聘制需要：聘用單位自己的設(shè)計(jì)和實(shí)踐，有專業(yè)水平和公心的同行認(rèn)真評(píng)審，單位負(fù)責(zé)預(yù)聘制晉升決策的委員會(huì)的水平和責(zé)任心。
目前中國(guó)大多數(shù)大學(xué)是否具備所有條件，恐怕可以畫(huà)很大的問(wèn)號(hào)。
就是在條件完全具備的美國(guó)著名大學(xué)和美國(guó)不著名的小大學(xué)，也都出現(xiàn)過(guò)問(wèn)題，而且繼續(xù)會(huì)出問(wèn)題。因?yàn)?，沒(méi)有體制是十全十美的，只能從多個(gè)可能中選取時(shí)間和空間合適的。
二十四小時(shí)的生物鐘，也稱為晝夜節(jié)律，對(duì)一些細(xì)菌和全部人類都很重要。
生物鐘的分子機(jī)理，突破在1971年Konopka和Benzer的論文。它報(bào)道自1968年以來(lái)，加州理工學(xué)院研究生Ron Konopka的實(shí)驗(yàn)。他發(fā)現(xiàn)，有一個(gè)基因，可以有三種突變，一種使果蠅完全失去晝夜節(jié)律，一種使果蠅的晝夜節(jié)律的周期延長(zhǎng)，一種使周期縮短。
Konopka和Benzer從一千九百多品系果蠅中篩到三只突變果蠅，竟然是同一個(gè)基因的三個(gè)影響完全不一樣的突變。遺傳學(xué)研究的歷史上可能只有這一次，生物學(xué)歷史可能也只有這一次。
（當(dāng)然，近年中國(guó)突然較多的生物學(xué)研究者，經(jīng)常做出公認(rèn)為很罕見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這里需要排除在世界科學(xué)正史的記錄之外，只適用于記錄歷史垃圾堆的高度）
Konopka不僅于1968年發(fā)現(xiàn)、1971年發(fā)表第一個(gè)影響生物鐘的基因，而且于1991年發(fā)表第二個(gè)影響果蠅生物鐘的基因Andante。
Konopka在研究過(guò)程中遇到了生物學(xué)史上空前絕后的運(yùn)氣，但個(gè)人際遇卻相當(dāng)不好。他畢業(yè)后到斯坦福大學(xué)做過(guò)短暫博士后，1974年回加州理工任助理教授，但評(píng)終身教授時(shí)未通過(guò)。他到Clarkson大學(xué)任教，再次未獲終身教授.
1990年,43歲的Konokpa不得已而退休，回到加州。參與輔導(dǎo)高中生。
2015年因心臟病去世。兩位研究果蠅生物鐘的科學(xué)家于當(dāng)年公開(kāi)撰文推崇Konopka的先驅(qū)工作（Rosbash， 2015；Hall，2015）。
2017年，三位科學(xué)家因?yàn)楣壣镧娧芯揩@諾貝爾獎(jiǎng)。他們都是研究果蠅生物鐘，包括2015年撰紀(jì)念文章的兩位。
Konopka沒(méi)有得到預(yù)聘制的終身教職，有他本人的因素。但預(yù)聘制不利于較長(zhǎng)時(shí)間沒(méi)有“產(chǎn)出”、或容易被低產(chǎn)出的科學(xué)家，也是事實(shí)。
當(dāng)然，如果有非常好的評(píng)審委員會(huì)，Konopka就是1990年的文章，也應(yīng)該可以Clarkson大學(xué)的終身教職。但顯然，委員會(huì)不夠好。
Konopka RJ and Benzer S (1971) Clock mutants of Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Science USA 68:2112-2116.
Konopka RJ, Smith RF and Orr D (1991) Characterization of Andante, a new Drosophila clock mutant, and its interactions with other clock mutants. Journal of Neurogenetics 7:103-114.
附：
2017年筆者發(fā)表的生物鐘的介紹（也是《生物學(xué)概念與途徑》的第11章）
11 遺傳和分子篩選
研究生物學(xué)不僅需要重視思考概念，而且需要重視研究途徑。
面臨的生物學(xué)問(wèn)題或過(guò)程，需要選擇合適的方法或方法的組合，形成有效的途徑，提出解決問(wèn)題的方案，剖析生物學(xué)機(jī)理。生物學(xué)的研究方法有來(lái)自生物學(xué)本身（如遺傳、生物檢定），也有來(lái)自物理（如電生理、光學(xué)成像、磁學(xué)技術(shù)）、更多來(lái)自化學(xué)（如化學(xué)分析），還有計(jì)算和數(shù)學(xué)等等。
本章專注討論遺傳篩選為核心研究途徑，同時(shí)討論依據(jù)功能的分子生物學(xué)篩選。
篩選可以有多種，在不同水平（如系統(tǒng)、環(huán)路、細(xì)胞、分子）、或不同技術(shù)進(jìn)行篩選。最基本的遺傳篩選是通過(guò)基因突變，找到參與生物學(xué)過(guò)程的基因，根據(jù)基因產(chǎn)物作用的原理，結(jié)合人工操縱基因和操縱表達(dá)基因的細(xì)胞，推論生物學(xué)過(guò)程的分子和細(xì)胞機(jī)理。
11.1 行為研究的范式
行為是可以被其他動(dòng)物和人類研究者所觀察到的動(dòng)物外在動(dòng)作表現(xiàn)。
行為研究的范式在1960年以前比較簡(jiǎn)單，以描述現(xiàn)象為主，而機(jī)理研究不多。俄國(guó)科學(xué)家巴甫洛夫（Ivan Pavlov, 1849-1936）發(fā)現(xiàn)條件反射。例如：狗見(jiàn)到食物會(huì)分泌唾液，而鈴聲不會(huì)誘導(dǎo)狗分泌唾液，但在鈴聲與食物多次同時(shí)出現(xiàn)后，單獨(dú)出現(xiàn)鈴聲也可誘導(dǎo)狗分泌唾液，說(shuō)明聲音刺激與食物刺激之間可以建立聯(lián)系。巴甫洛夫稱食物為無(wú)條件刺激，鈴聲為條件刺激，對(duì)條件刺激的反應(yīng)為條件反射。這種簡(jiǎn)單的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)是20世紀(jì)初行為研究的重要進(jìn)展。
行為既與生理學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)相關(guān)，也是心理學(xué)的內(nèi)容。行為主義開(kāi)創(chuàng)者John B Watson（1878-1958）于1913年發(fā)表《行為學(xué)主義者宣言》，提出人和動(dòng)物的行為由后天經(jīng)歷所塑造。他是美國(guó)心理學(xué)家和教育家杜威的研究生，后任教于霍普金斯大學(xué)。1920年他和助手11個(gè)月的男孩Albert做實(shí)驗(yàn)，試圖說(shuō)明只需后天就能刺激建立恐懼的情緒反應(yīng)。Albert本不怕的有毛的動(dòng)物如大鼠、兔、狗，但聽(tīng)見(jiàn)鐵棒噪音會(huì)哭。如果在Albert摸到大鼠時(shí)讓他同時(shí)聽(tīng)到鐵棒噪音，經(jīng)過(guò)幾次訓(xùn)練，Albert不敢摸鼠、甚至哭，而且也怕其他有毛動(dòng)物（兔、狗） (Watson and Rayner, 1920)。
美國(guó)心理學(xué)家B. F. Skinner（1904-1990）推廣行為主義。他設(shè)計(jì)了一種新的實(shí)驗(yàn)：操作性條件反射。巴甫洛夫的條件反射只看動(dòng)物的被動(dòng)的生理反應(yīng)（分泌唾液）、不看其主動(dòng)行為（動(dòng)作）。Skinner用鴿子做實(shí)驗(yàn)，在鴿籠裝兩個(gè)鈕，鴿子碰一個(gè)鈕會(huì)得到吃的獎(jiǎng)賞，觸另一鈕無(wú)獎(jiǎng)。一段時(shí)間后，鴿子會(huì)經(jīng)常去碰有獎(jiǎng)鈕，這種條件反射為操作性條件反射，迄今仍為研究學(xué)習(xí)記憶的重要模型之一。
奧地利的Konrad Lorenz （1903-1989）和Karl von Frisch（1886-1982）、荷蘭的Nikolaas Tinbergen（1907-1988）研究動(dòng)物行為。von Frisch研究蜜蜂的行為有多個(gè)發(fā)現(xiàn)，如蜜蜂有識(shí)別偏振光的能力。更為一般所知的發(fā)現(xiàn)是蜜蜂舞蹈：蜜蜂發(fā)現(xiàn)食物后，飛回蜂巢通過(guò)舞蹈的模式告訴其他蜜蜂食物的遠(yuǎn)近和角度、食物的多少。Tinbergen和Lorenz研究動(dòng)物的本能行為。本能的行為是天生行為。本能并不一定是幼年表現(xiàn)，比如生殖行為無(wú)需教導(dǎo)、也無(wú)需觀察而在一定年齡后才表現(xiàn)。Tinbergen和Lorenz發(fā)現(xiàn)動(dòng)物的刻板動(dòng)作，如在交配后，公鵝有一套特定動(dòng)作；而有些特征可刺激魚(yú)視之為敵而攻擊。Lorenz還發(fā)現(xiàn)行為的印跡（imprinting）。他用灰腿鵝做實(shí)驗(yàn)，出生最初期小鵝看見(jiàn)什么動(dòng)就跟著什么，如果小鵝見(jiàn)到的移動(dòng)物體只是Lorenz本人，那么以后這些鵝視Lorenz為母親，他走到哪里，它們跟到哪里，甚至長(zhǎng)大后碰見(jiàn)真鵝，它們猶豫再三還是跟著Lorenz本人。印跡只能在特定時(shí)期產(chǎn)生，稱為臨界期。1951年Tinbergen總結(jié)研究行為的四個(gè)方面，兩個(gè)為近端原因（proximate causes）：發(fā)育（行為如何在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中形成），機(jī)理（個(gè)體行為的原理）。兩個(gè)終極原因（ultimate causes）：進(jìn)化，和功能（如打架是為了搶食物、或爭(zhēng)配偶）。迄今為止，大多數(shù)行為的研究在四個(gè)方面都不是很深入。甚至還有停留在描述的程度行為研究。如2009年von Bayern等的論文，描述烏鴉如何被迫用小石頭幫助自己獲得嘴夠不著的食物。
11.2 生物鐘
生物鐘的研究屬于行為研究的范疇。通過(guò)觀察行為是了解生物鐘現(xiàn)象的途徑，也是檢測(cè)生物鐘的簡(jiǎn)便方法。
生物鐘是生物節(jié)律的俗稱，人們熟知多種：動(dòng)物的晝行夜伏、植物的春華秋實(shí)…。常見(jiàn)的近24小時(shí)晝夜節(jié)律(circadian rhythm)是典型的生物鐘之一。生物鐘的現(xiàn)象看似簡(jiǎn)單，其實(shí)不盡然。例如：每天早上并非太陽(yáng)出來(lái)在先、向日葵指向東方在后，而是相反。而理解生物鐘的本質(zhì)就更不容易。
生物節(jié)律與其他節(jié)律一樣，有振蕩的幅度、周期、相位。節(jié)律是生物鐘的外在表現(xiàn)，生物鐘是內(nèi)在的定時(shí)機(jī)理。生物鐘本身是自我維持的生理和行為節(jié)律發(fā)生器（pacemaker），可以受外界環(huán)境因素（zeitgebers）所影響、可以同步化。
生物有多種節(jié)律，不同的生物有著不同的節(jié)律，同一生物也有多種節(jié)律。有些動(dòng)物每年一個(gè)周期的冬眠、有些植物每年一個(gè)周期的長(zhǎng)葉落葉，動(dòng)物還有更快的周期如呼吸和心跳…，而人們熟知的節(jié)律是晝夜節(jié)律。不僅大家熟悉的睡眠有晝夜節(jié)律，一些其他行為和有些生理指標(biāo)也有晝夜節(jié)律。
公元四世紀(jì)，Androsthenes知道羅望子樹(shù)樹(shù)葉的運(yùn)動(dòng)有晝夜差別(McClung, 2006)。意大利的Santorio Santorio（1561-1636）前后30年記錄自己從早到晚的攝食量、排泄量和體重變化，發(fā)現(xiàn)有晝夜規(guī)律。但他們未能區(qū)分外界影響的節(jié)律與生物自主的節(jié)律。1729年，法國(guó)天文學(xué)家Jacques Ortous de Mairan（1678-1771）用含羞草做材料，觀察其葉片和花的變化。含羞草放置在全暗處一段時(shí)間，葉片仍然有張有合，不依賴陽(yáng)光，但他當(dāng)時(shí)沒(méi)敢提出植物的晝夜節(jié)律是內(nèi)在的（de Mairan，1729；Szymanski，1918）。達(dá)爾文也研究過(guò)植物的節(jié)律，并提出晝夜節(jié)律的可遺傳性（Darwin and Darwin，1880）?，F(xiàn)在通過(guò)紅外照相機(jī)可以看到年輕的向日葵朝向東方早于日出，所以也有內(nèi)在節(jié)律所驅(qū)動(dòng)的環(huán)節(jié)，雖然白天向日葵還有趨光性的環(huán)節(jié)（Atamian et al., 2016）。晝夜節(jié)律并不依賴于地球自轉(zhuǎn)：放到太空，節(jié)律照常（Sulzman et al., 1984）。
Aschoff 和Wever (1976)總結(jié)人的晝夜節(jié)律，德國(guó)大學(xué)生待在二戰(zhàn)留下的堡壘中，燈光恒定、食物恒定、溫度恒定、聲音控制。在外界環(huán)境線索缺乏的情況下，人們?nèi)匀槐３謺円构?jié)律，只是在十幾天后相位滯后。
現(xiàn)在知道，從簡(jiǎn)單的單細(xì)胞細(xì)菌藍(lán)綠藻到多細(xì)胞的人，很多生物有節(jié)律。晝夜節(jié)律周期接近24小時(shí)（常見(jiàn)22至25小時(shí)）。節(jié)律的相位由最后一次環(huán)境線索（如光、或溫度等）所確定。在缺乏環(huán)境線索時(shí)可以繼續(xù)維持，在環(huán)境噪音中，節(jié)律也照常運(yùn)行。在一定范圍內(nèi)，節(jié)律周期并不隨溫度的改變而劇烈改變，有溫度補(bǔ)償機(jī)制，這不同于一般生化反應(yīng)：如溫度每上升10℃，酶的催化活性提高一倍。
地球上生物生長(zhǎng)的能量來(lái)自太陽(yáng)，太陽(yáng)的光照過(guò)強(qiáng)也會(huì)對(duì)生物的大分子造成破壞，因此地球上的生物有要應(yīng)對(duì)陽(yáng)光強(qiáng)度周期性變化的要求。
藍(lán)綠藻有晝夜節(jié)律，把生物鐘正常的與周期異常的藍(lán)綠藻在一起長(zhǎng)期培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)最后生物鐘正常的細(xì)菌占了絕大多數(shù)，由此可見(jiàn)生物鐘對(duì)生物體有利（Ouyang et al., 1998；Woelfle et al., 2004）。
通過(guò)研究正常擬南芥及周期縮短或延長(zhǎng)的擬南芥突變種，發(fā)現(xiàn)從固碳量、生長(zhǎng)、存活來(lái)看，周期與環(huán)境設(shè)定晝夜周期相吻合的擬南芥最適合，即：短周期突變株在20小時(shí)晝夜環(huán)境下生活得更好；而長(zhǎng)周期突變株在28小時(shí)的模擬環(huán)境下更好（Dodd et al., 2005）。這些觀察，反應(yīng)了只有當(dāng)內(nèi)外源周期保持一致時(shí)才最有利于植物生長(zhǎng)。
觀察到周期正常有利于植物，不等于能夠解釋為什么，所以我們?nèi)匀皇侵淙?、不知其所以然?/p>
11.3 生物鐘研究的新人和新途徑
怎么研究生物鐘？
能看到動(dòng)物、植物的變化，是外在表現(xiàn)，可以看到鐘的長(zhǎng)針、短針運(yùn)動(dòng)的軌跡，不等于理解了指揮它們運(yùn)動(dòng)的機(jī)械裝置。而生物鐘的核心在于振蕩發(fā)生器。
早期科學(xué)家用電生理研究生物鐘，用電極記錄細(xì)胞電活動(dòng)，曾觀察到哺乳類腦內(nèi)特定部位視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）的電活動(dòng)有晝夜周期。在鳥(niǎo)類發(fā)現(xiàn)松果體很重要（Gaston and Menaker，1968；Zimmerman and Menaker，1979）。一系列研究表明SCN為哺乳類動(dòng)物的主鐘（master clock）、松果體為鳥(niǎo)類的主鐘。損毀主鐘導(dǎo)致動(dòng)物失去晝夜節(jié)律（Moore and Eichler，1972；Stephan and Zucker，1972）；將主鐘加回?fù)p毀后的動(dòng)物可恢復(fù)晝夜節(jié)律（Lehman et al., 1987）；在搗毀后，移植其他動(dòng)物的主鐘，新節(jié)律與移植物來(lái)源的動(dòng)物節(jié)律一樣，例如，如果移植物來(lái)自周期22小時(shí)的動(dòng)物，那么接受移植的動(dòng)物周期也是22小時(shí)，而如果移植物來(lái)自周期20小時(shí)的動(dòng)物，接受移植的動(dòng)物也獲得20小時(shí)的周期（Ralph et al., 1990）。
遺傳學(xué)從孟德?tīng)柦?jīng)摩爾根到1960年代初主要研究遺傳的原理，揭示個(gè)體和群體的遺傳規(guī)律。而1960年代末開(kāi)始，遺傳學(xué)作為重要的工具，成為研究生物現(xiàn)象的途徑。通過(guò)突變觀察到基因異常導(dǎo)致的表型，推論基因正常的功能，了解生物學(xué)機(jī)理。將遺傳學(xué)作為研究途徑的早期代表為美國(guó)生物學(xué)家Leland Hartwell（1939-），他率先篩選酵母細(xì)胞分裂的遺傳突變，推論參與細(xì)胞分裂的基因，推動(dòng)理解細(xì)胞周期的分子機(jī)理，也有助于理解癌癥。通過(guò)異常現(xiàn)象了解正常規(guī)律，通過(guò)個(gè)別例外發(fā)現(xiàn)普適原理，是遺傳學(xué)作為研究途徑的特征。用遺傳篩選研究生物現(xiàn)象，所謂正向遺傳學(xué)，隨機(jī)篩選影響特定生物現(xiàn)象的突變，無(wú)需假設(shè)機(jī)理。這是遺傳篩選的優(yōu)點(diǎn)，但當(dāng)時(shí)傾向于認(rèn)為遺傳篩選有很大的缺點(diǎn)：很多行為恐怕不是單個(gè)或幾個(gè)基因所決定的，復(fù)雜的行為需要有很多基因參與，用遺傳篩選對(duì)單個(gè)和少數(shù)基因參與的過(guò)程有效，對(duì)更多基因參與的行為可能效果很差。影響行為的基因也可能影響其他生理過(guò)程，從而難以區(qū)分是否參與特定行為的基因。有些看起來(lái)影響行為的基因，其作用可能很間接，如先影響發(fā)育后導(dǎo)致行為變化。即使在已經(jīng)多次證明遺傳篩選很有效的今天，對(duì)于特定篩選的懷疑仍然存在。
紐約出生的波蘭猶太移民后裔本哲（Seymour Benzer，1921-2007）在大學(xué)年物理專業(yè)，1945年至1953年任教于普度大學(xué)物理系，先研究過(guò)當(dāng)時(shí)的熱門(mén)：鍺（Benzer, 1946）。1948年他開(kāi)始通過(guò)參加暑期課程、訪問(wèn)實(shí)驗(yàn)室來(lái)學(xué)習(xí)生物。1953年轉(zhuǎn)到生物系任教，在分子生物學(xué)有兩個(gè)很重要的工作：他證明遺傳突變就是DNA堿基序列的變化（Benzer, 1955）；他提出基因的順?lè)醋佣x（Benzer, 1959）。1960年代，幾位分子生物學(xué)的開(kāi)創(chuàng)者一道轉(zhuǎn)行研究神經(jīng)生物學(xué)。他們包括英國(guó)科學(xué)家、DNA雙螺旋共同發(fā)現(xiàn)者Francis Crick（1916-2004），南非出生的猶太裔英國(guó)科學(xué)家、mRNA發(fā)現(xiàn)者Sydney Brenner（1927-），和本哲等。他們認(rèn)為，分子生物學(xué)的重要問(wèn)題已解決、框架已建立，只有細(xì)節(jié)給后輩，而他們應(yīng)該找下一個(gè)重要的領(lǐng)域。他們都選了神經(jīng)生物學(xué)：Crick決定研究意識(shí)；Brenner決定需要新的模式生物研究神經(jīng)生物學(xué)，他挑選了秀麗線蟲(chóng)，開(kāi)發(fā)了線蟲(chóng)的遺傳學(xué)，帶出一批學(xué)生用線蟲(chóng)研究了發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)，于2002年因?yàn)檠芯烤€蟲(chóng)獲獎(jiǎng)。本哲學(xué)習(xí)神經(jīng)生物學(xué)后，決定用果蠅研究行為。1967年，本哲轉(zhuǎn)到加州理工學(xué)院，并開(kāi)始發(fā)表果蠅行為的遺傳學(xué)研究論文（Benzer，1967）。
本哲自1967年至2007年一直研究果蠅的行為。研究神經(jīng)生物學(xué)的初期，不僅同事笑他（研究腦袋愚蠢的果蠅，是不是研究者腦袋有毛?。琂erry Hirsch （1922-2008）曾認(rèn)為不能用單基因解釋、也就難以通過(guò)遺傳篩選的方法研究果蠅行為，只能同時(shí)改變很多基因進(jìn)行代間選擇來(lái)推斷。而本哲認(rèn)為果蠅的行為可以用突變單個(gè)基因的前饋遺傳學(xué)來(lái)進(jìn)行研究。1970年代，他們?cè)l(fā)生激烈爭(zhēng)論，Hirsch甚至給本哲所在加州理工學(xué)院的每一個(gè)教授寫(xiě)信稱本哲的研究是偽科學(xué)?！奥斆鳌钡摹⑾氤晒Φ娜撕芏嗖⒉粯?lè)意做本哲的學(xué)生。早期他們的學(xué)生要么不求功利、要么不懂生物、要么……。其后四十年的實(shí)踐證明，本哲和他的學(xué)生們研究的很多方面都領(lǐng)先世界，包括學(xué)習(xí)記憶、性行為、離子通道、眼發(fā)育、人類神經(jīng)退行性疾病的果蠅模型等。
11.4 偷懶是創(chuàng)新之母
1971年和1972年出現(xiàn)三篇用遺傳學(xué)研究生物鐘的文章：影響果蠅生物鐘的基因突變（Konopka and Benzer，1971）、影響真菌（紅色面包霉）生物鐘的基因突變（Feldman and Wasar，1971）、影響綠藻生物鐘的基因突變（Bruce，1972）。
早在1935年就知道果蠅有生物節(jié)律（Kalmus，1935）。因?yàn)楣壍难芯空叨?，其研究工具多于真菌和綠藻，加上研究果蠅生物鐘的科學(xué)家前赴后繼，最終研究果蠅對(duì)生物鐘的理解起到的推動(dòng)作用最大。在本哲用遺傳研究行為的總體框架中，具體提出用果蠅篩選生物鐘基因突變的是研究生Ronald Konopka（1947-2015）（Rosbash，2015）。
遺傳篩選的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是：建立檢測(cè)表型的方法，用致變劑誘導(dǎo)特定生物的不同基因發(fā)生突變，檢測(cè)不同突變種的表型。具體到果蠅的生物鐘，就應(yīng)該是建立檢測(cè)生物鐘的方法，用化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)不同基因突變，然后一只一只檢測(cè)果蠅，以便發(fā)現(xiàn)改變了晝夜節(jié)律的突變種。
1970年代初無(wú)人知道果蠅有約兩萬(wàn)個(gè)基因，化學(xué)分子誘發(fā)隨機(jī)突變，只做兩萬(wàn)只果蠅不夠，其中部分突變?cè)谙嗤?，所以?yīng)該加幾倍到幾百倍，才可能大部分基因都突變過(guò)一次。因行為有漂移，一個(gè)基因的突變種，不能僅檢測(cè)一只果蠅，應(yīng)該檢測(cè)幾只到幾十只。果蠅是二倍體，每個(gè)基因有兩套，一套壞了可以被另一個(gè)等位基因所代償，所以最好不要做子一代（F1）的篩選，而最好是F2代，傳代后再篩選，而F2代只有四分之一是同一基因突變的純合子那么需要篩選的數(shù)量應(yīng)一兩百萬(wàn)，才能保證對(duì)果蠅所有基因進(jìn)行了一遍篩選（所謂全基因組篩選）。
檢測(cè)果蠅晝夜節(jié)律的標(biāo)準(zhǔn)方法，是將單只果蠅放到透明的管中，管子只容一只果蠅來(lái)回走動(dòng)。一束光射過(guò)小管的中央，凡是果蠅走過(guò)管中央，計(jì)算機(jī)就記錄果蠅運(yùn)動(dòng)了一次。以此檢測(cè)果蠅活動(dòng)的變化，發(fā)現(xiàn)確實(shí)有晝夜規(guī)律。但如果需要篩選檢測(cè)很多果蠅，工作量就比較大。
Konopka和Benzer用了兩個(gè)偷工減料方法來(lái)加快速度。其一是他們決定不篩選晝夜節(jié)律，而篩另一節(jié)律：果蠅羽化。果蠅受精卵成為胚胎，發(fā)育成為幼蟲(chóng)，三次蛻皮后成為蛹，蛹經(jīng)羽化成為成蟲(chóng)。
晝夜活動(dòng)節(jié)律是果蠅成蟲(chóng)每天經(jīng)歷一次、幾十天周而復(fù)始的循環(huán)。而果蠅一生僅羽化一次。正常果蠅羽化一般在黎明前，最遲也在上午。上世紀(jì)三十年代至五十年代的研究明確提出羽化為獨(dú)立于溫度的生物鐘所控制（Kalmus，1935，1940a，1940b，Pittendrigh，1954）。但是，一生一次的羽化的生物鐘與成蟲(chóng)每天活動(dòng)的生物鐘是否有關(guān)，當(dāng)時(shí)并不清楚。
Konopka覺(jué)得羽化作為篩選方法很容易操作。用單只果蠅做經(jīng)典的晝夜活動(dòng)規(guī)律檢測(cè)比較慢。如果用羽化作為篩選方法，就很便當(dāng)：化學(xué)誘變處理得到各種突變的果蠅后，Konopka每天上午不來(lái)上班，午后到實(shí)驗(yàn)室把所有羽化的果蠅倒掉，留下其他蛹，下午到晚上再羽化的就是影響節(jié)律的突變種，因?yàn)樗鼈兊挠鸹瘯r(shí)間不同于“正?！保ㄒ吧停┕墶＿@樣的方法大大簡(jiǎn)化了檢測(cè)、加速了篩選。
Konopka和Benzer偷懶的另外一個(gè)方面是遺傳學(xué)捷徑。他們用了附著X染色體。附著X是果蠅的一種突變。其發(fā)現(xiàn)者是摩爾根的妻子Lilian Morgan。她本是獨(dú)立的科學(xué)家，但與摩爾根結(jié)婚后暫停工作十幾年，生兒育女后重返實(shí)驗(yàn)室。她五十多歲獨(dú)立發(fā)現(xiàn)含附著X的果蠅（Morgan，1922）。這一突變對(duì)果蠅研究很有用處：化學(xué)誘變雄性果蠅，使其X染色體突變，然后與附著X的雌性果蠅交配，獲得的F1存活的后代中，所有雄性都攜帶來(lái)自F0雄性的突變、而且只要F0有表型就必定F1也有表型，F(xiàn)1代所有雌性都不含突變。這樣，只要挑雄果蠅就可以，而雌雄很容易從外表區(qū)分，只要獲得生物鐘突變之后，以后無(wú)需每一代檢測(cè)生物鐘來(lái)追尋、保持突變種。
如果不用附著X的雌性，在F1代的雄性有三分之二果蠅不含突變，F(xiàn)1的雌性含F(xiàn)0的突變、但若是隱形突變就不會(huì)有表型。那么每一代需要通過(guò)檢測(cè)生物鐘來(lái)鑒定生物鐘的突變，保持生物鐘的突變，需要的工作量就大很多。如果不研究X染色體，而研究其他染色體的突變，工作量就更大。
Konopka和Benzer用了附著X，交配和篩選簡(jiǎn)單，加快了篩選速度。做先驅(qū)是有好處的：可以選的路徑和方法有自由度，先選容易的。容易的方法如果被窮盡了，后面的人只好用麻煩的方法。先驅(qū)的危險(xiǎn)是定錯(cuò)了方向、選錯(cuò)了課題。
偷懶，依賴人腦想辦法的偷懶，（有時(shí)）是創(chuàng)新之母。
11.5 生物鐘研究的突破
對(duì)一個(gè)研究生來(lái)說(shuō)，用如此簡(jiǎn)單的方法，可以篩選幾萬(wàn)只、幾十萬(wàn)只、幾百萬(wàn)只果蠅。但Konopka只篩選了不到兩百種品系的果蠅就得到第一個(gè)失去周期突變品系，繼續(xù)篩選約一千九百種品系的果蠅再得到兩個(gè)突變品系（分別是周期縮短和周期延長(zhǎng)）。
用羽化篩到突變品系后，更重要的是用檢測(cè)個(gè)體運(yùn)動(dòng)的方法看晝夜活動(dòng)是否變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)確實(shí)突變果蠅運(yùn)動(dòng)的晝夜節(jié)律也有異常。有趣的是，他們發(fā)現(xiàn)的三種品系的突變果蠅在表型上并不相同：一種是無(wú)節(jié)律，一種節(jié)律縮短到19小時(shí)，一種節(jié)律變慢到28小時(shí)。他們交配突變果蠅以確立三種突變?cè)谌旧w圖譜的大概位置，結(jié)果發(fā)現(xiàn)很近，他們進(jìn)一步進(jìn)行本哲發(fā)明的順?lè)礄z測(cè)，試圖確立它們是否同一基因，他們根據(jù)得到的結(jié)果推測(cè)三種突變可能是同一個(gè)基因的不同突變。他們把這個(gè)基因命名為Period（Per），無(wú)節(jié)律的為Per0（per zero）、短節(jié)律的為Pers（per short）、長(zhǎng)節(jié)律的為Perl（per long）。這里需要說(shuō)明，他們進(jìn)行的順?lè)礄z測(cè)并不嚴(yán)格，只做了反位（trans）的檢測(cè)沒(méi)做順位（cis）的檢測(cè)，所以只從1971年的文章不能完全斷定三個(gè)突變是否同一基因，雖然支持這一可能。
他們篩選的果蠅數(shù)量不多，卻得到了一個(gè)基因的三種不同方向的突變，因此特別有運(yùn)氣。
各種篩選和檢測(cè)生物鐘的方法，都有可能在一些非生物鐘關(guān)鍵的基因?qū)е碌耐蛔兌兴绊?。同一個(gè)基因可以出現(xiàn)三個(gè)方向的突變，不僅是運(yùn)氣，而且對(duì)于這個(gè)基因的功能也提供了很好的支持：很難設(shè)想不參與驅(qū)動(dòng)生物鐘的基因可以導(dǎo)致三個(gè)不同方向的突變表型。如果三個(gè)突變確為一個(gè)基因的三種突變，那么Per基因很可能是生物鐘的關(guān)鍵基因之一。
德國(guó)物理學(xué)家轉(zhuǎn)美國(guó)生物學(xué)家的Max Delbrück（1906-1981）是本哲在加州理工學(xué)院的同事。本哲于1940年代末跟他學(xué)了生物、1969年因?yàn)殚_(kāi)創(chuàng)噬菌體研究獲諾獎(jiǎng)。他不信Konopka和本哲找到了生物鐘的基因：
Delbrück: “No, that’s impossible ”
Benzer: “But Max, he’s already done it!”
Delbrück: “No, that is impossible.”
11.6 克隆per基因：競(jìng)爭(zhēng)的好處
1971年，因?yàn)榧夹g(shù)缺乏，不可能得到per基因的DNA（“克隆基因”）。重組DNA技術(shù)于1973年才發(fā)明，而克隆果蠅DNA的技術(shù)還要等到1978年斯坦福大學(xué)的David Hogness（1925-2019）和加州理工學(xué)院的Tom Maniatis（1943）等人的工作推動(dòng)下才能進(jìn)行。等到所有技術(shù)都成熟以后才開(kāi)始研究是明顯的事情，但也很容易成為跟風(fēng)；不等到技術(shù)成熟，就開(kāi)始研究才是開(kāi)拓。但這種領(lǐng)先有很大的風(fēng)險(xiǎn)，如果領(lǐng)先幾十年，可能開(kāi)拓者一生也看不到下一步，也就不很確定自己的開(kāi)拓是有效，是否誤導(dǎo)大家走進(jìn)了死胡同。
1980年代是基因克隆的烽火連天時(shí)代。針對(duì)果蠅的per基因，兩個(gè)團(tuán)隊(duì)競(jìng)爭(zhēng)克?。郝蹇朔评沾髮W(xué)的楊邁克（Michael Young，1949-）；Brandeis大學(xué)的霍爾（Jeffrey Hall，1945-）與羅斯巴希（Michael Rosbash，1944-）。楊邁克本科的時(shí)候跟德克薩斯大學(xué)的Burke Judd從事研究，Judd的興趣是研究果蠅染色體上基因的分布，特別是研究了X染色體上一小段上有多少基因。楊邁克的研究生課題就繼續(xù)研究X染色體的基因，他讀到Konopka和Benzer的文章后，意識(shí)到Per基因應(yīng)該就在他們研究的區(qū)段。楊邁克就要來(lái)Konopka的果蠅，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明自己不久前發(fā)現(xiàn)的一個(gè)突變T(1,4)JC43也是Per基因的突變，因?yàn)檫@一突變是染色體移位，以后將有助于在克隆DNA過(guò)程中定位Per基因的邊界。他在做博士后期間跟斯坦福大學(xué)的David Hogness，學(xué)習(xí)克隆DNA技術(shù)。楊邁克到洛克菲勒任教后，試圖克隆兩個(gè)果蠅的基因：與耶魯大學(xué)的希臘裔生物學(xué)家Spiros Artavanis-Tsakonas（1946-）競(jìng)爭(zhēng)克隆Notch基因；Per基因。
霍爾跟本哲做博士后而研究果蠅，到Brandeis大學(xué)后繼續(xù)研究果蠅，包括參與果蠅的性行為的fruitless基因。羅斯巴希多年用酵母研究mRNA剪接機(jī)理，實(shí)驗(yàn)室搬到霍爾同一大樓后，兩實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始合作克隆Per基因。
1984年，楊邁克和霍爾—羅斯巴希兩個(gè)團(tuán)隊(duì)都拿到Per基因附近的基因組DNA（Bargiello and Young，1984；Reddy et al., 1984; Zehring et al., 1984）。這段DNA產(chǎn)生兩個(gè)不同長(zhǎng)度的mRNA：分別為4.5kb（千堿基對(duì)）和0.9kb，而且對(duì)應(yīng)兩個(gè)基因?；魻枴_斯巴希組觀察到0.9kb之mRNA的含量有晝夜變化（Reddy et al., 1984; Zehring et al., 1984），認(rèn)為相應(yīng)的DNA為Per基因。楊邁克認(rèn)為4.5kb對(duì)應(yīng)Per基因。后來(lái)兩個(gè)團(tuán)隊(duì)都確認(rèn)4.5kb是Per基因（Bargiello et al., 1984； Hamblen et al., 1986; Lorenz et al., 1989）。將編碼4.5kb mRNA的DNA轉(zhuǎn)入果蠅，可以使Per突變種果蠅的晝夜節(jié)律恢復(fù)正常。改變導(dǎo)入的Per基因表達(dá)的相位可改變果蠅晝夜節(jié)律的相位（Edery et al., 1994）。
在兩個(gè)團(tuán)隊(duì)的競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程中，一個(gè)團(tuán)隊(duì)出現(xiàn)錯(cuò)誤（霍爾—羅斯巴希組最初錯(cuò)認(rèn)了Per基因），被另一團(tuán)隊(duì)所糾正，是競(jìng)爭(zhēng)對(duì)科學(xué)的好處。
兩組科學(xué)家都確定了Per基因在最初三種影響生物鐘突變株的DNA變化：Per0所含堿基變化導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成提前終止，Pers、Perl分別是兩個(gè)不同部位的單堿基變化（Baylies et al., 1987; Yu et al., 1987a）。
霍爾—羅斯巴希組的俞強(qiáng)還發(fā)現(xiàn)，缺失Per蛋白質(zhì)特定一段區(qū)域，晝夜活動(dòng)節(jié)律不受影響，只影響求偶時(shí)果蠅翅膀有節(jié)律的歌唱（Yu et al., 1987b）。霍爾實(shí)驗(yàn)室在1980年發(fā)現(xiàn)果蠅求偶時(shí)的翅膀振蕩有節(jié)律（Kyriacou and Hall，1980），不過(guò)其后有爭(zhēng)議至今（Stern, 2014; Kyriacou et al., 2017; Stern et al., 2017）。
11.7 Per的功能：競(jìng)爭(zhēng)的壞處
克隆到基因令人鼓舞。
但是，得到基因不一定就能懂得機(jī)理。例如，單純測(cè)序人類基因組只是工具，而不是美國(guó)總統(tǒng)等政治人物與羞恥感較弱的科技工作者齊稱測(cè)序人類基因組就揭示了人類奧秘，其實(shí)單純測(cè)序不可能自動(dòng)解開(kāi)人類奧秘，所以今天對(duì)人類的奧秘還遠(yuǎn)不清楚。通過(guò)表型找到基因，是了解功能的重要一步，優(yōu)于單純測(cè)序。不過(guò)，拿到了Per基因的DNA，并不知道它所編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的功能，也不能立即推導(dǎo)出生物鐘的機(jī)理。其實(shí)有些基因被發(fā)現(xiàn)很長(zhǎng)時(shí)間后，人們都不能理解其機(jī)理。例如，患“萊－尼” （Lesch-Nyhan）綜合征的病人是很特殊的疾病：病人自殘。而其基因已知多年，它編碼的HGPRT（次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）是核酸代謝的一個(gè)酶，但人類迄今并不理解為什么缺HGPRT的病人會(huì)自殘。
兩個(gè)組都看到Per蛋白質(zhì)有部分序列是重復(fù)的，楊邁克實(shí)驗(yàn)室還以為果蠅Per重復(fù)序列與小鼠的序列相似（Shin et al., 1985），后來(lái)發(fā)現(xiàn)并非如此。要推導(dǎo)出一個(gè)基因所編碼蛋白質(zhì)的功能，如果其預(yù)計(jì)的氨基酸序列與其他某種已知蛋白質(zhì)有相似性，那么功能可能類似，從而提供研究的著力點(diǎn)。1986年，兩個(gè)課題組都發(fā)表文章稱Per蛋白質(zhì)是蛋白多糖（Jackson et al., 1986; Reddy et al., 1986）。這次兩個(gè)課題組都錯(cuò)了，競(jìng)爭(zhēng)的課題組對(duì)成一樣是合理的，而錯(cuò)成一樣是咄咄怪事。
1987年，楊邁克課題組與愛(ài)因斯坦醫(yī)學(xué)院的David Spray實(shí)驗(yàn)室合作發(fā)表文章（Bargiello et al., 1987），稱Per影響了細(xì)胞間交流（提示Per可能起縫隙連接相關(guān)的功能，比如縫隙蛋白），這一結(jié)果很可能是從猜測(cè)Per是蛋白多糖——可能是膜蛋白——也就有可能是縫隙蛋白而推論。但是，Per突變影響縫隙連接的結(jié)果不能重復(fù)，1992年楊邁克和Spray發(fā)表道歉、收回1987年的文章(Saez et al., 1992)。霍爾—羅斯巴希組于1993年也發(fā)表文章認(rèn)為Per不參與細(xì)胞間連接（Flint et al., 1993）。
從1984至1987，在激烈競(jìng)爭(zhēng)的過(guò)程中，兩個(gè)課題組都錯(cuò)了兩次：各自分別錯(cuò)了一次，同時(shí)錯(cuò)了一次。
11.8 Per mRNA的研究：仔細(xì)不是壞事
克隆了基因，研究很自然的下一步包括檢測(cè)基因表達(dá)。
檢測(cè)基因表達(dá)可以通過(guò)檢測(cè)mRNA的表達(dá)或蛋白質(zhì)。一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)動(dòng)物的絕大多數(shù)細(xì)胞含同樣的DNA，而含有不同的mRNA和蛋白質(zhì)?；魻枴_斯巴希組、楊邁克組都檢測(cè)Per mRNA和Per蛋白質(zhì)表達(dá)在什么時(shí)間和空間（James et al., 1986；Saez and Young, 1988；Liu et al., 1988；Siwicki et al., 1988；Zerr et al., 1990；Liu et al., 1992），其中檢測(cè)蛋白質(zhì)需要費(fèi)了很大的勁制造識(shí)別Per蛋白質(zhì)的抗體。他們發(fā)現(xiàn)Per蛋白質(zhì)既可以存在于細(xì)胞核、也可以存在于細(xì)胞質(zhì)（Saez and Young，1988；Siwicki et al., 1988；Liu et al., 1992）。
既然Per基因參與晝夜節(jié)律，那么其mRNA或蛋白質(zhì)是否也有晝夜周期？不難檢測(cè)mRNA含量，但最初未觀察到Per mRNA的晝夜變化。1990年，從果蠅頭部提取RNA，發(fā)現(xiàn)了Per mRNA有晝夜周期性變化。此前沒(méi)有觀察到變化的一種可能是做實(shí)驗(yàn)的人技術(shù)不好、或不仔細(xì)，另一可能是細(xì)節(jié)：傳說(shuō)最初在全身檢測(cè)Per mRNA，有可能身體其他部分（如腹部）所含RNA量大而不變掩蓋了頭部mRNA隨晝夜周期的變化。為什么需要專門(mén)研究頭部的Per?這與晝夜節(jié)律的關(guān)鍵部分存在于身體什么部位有關(guān)。在得到Per基因突變后，曾有實(shí)驗(yàn)在不同突變型的果蠅之間進(jìn)行局部區(qū)域組織細(xì)胞的移植，以確定哪個(gè)部位起決定性作用：從pers果蠅取得腦組織，移植到per0果蠅腹腔中，發(fā)現(xiàn)per0變成了pers，顯示腦是確定節(jié)律的部位（Handler and Konopka，1979）。1983年，離開(kāi)加州理工學(xué)院在Clarkson大學(xué)的Konopka等再用遺傳嵌合體（genetic mosaics）做實(shí)驗(yàn)：讓果蠅部分區(qū)域的細(xì)胞含突變的per（如pers），而其余部分仍然正常，結(jié)果發(fā)現(xiàn)如果腦含pers，果蠅的生物鐘就變短（Konopka et al., 1980）。所以，移植實(shí)驗(yàn)和嵌合體實(shí)驗(yàn)皆支持Per基因在腦中控制全身的晝夜節(jié)律。
1990年，霍爾—羅斯巴希組的博士后Paul Hardin從果蠅頭部取樣，24小時(shí)中每個(gè)小時(shí)取一些果蠅的頭制備mRNA，再檢測(cè)Per mRNA，發(fā)現(xiàn)它呈晝夜變化（Hardin，Hall，Rosbash，1990）。
在pers中，Per mRNA晝夜周期也縮短。他們提出簡(jiǎn)單的模型：Per基因轉(zhuǎn)錄Per mRNA、翻譯產(chǎn)生Per蛋白質(zhì)的過(guò)程存在負(fù)反饋，其mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)生后，可以影響Per基因自身的轉(zhuǎn)錄。他們當(dāng)時(shí)不能排除Per調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律這一行為之后，行為再通過(guò)更復(fù)雜的反饋?zhàn)饔糜?em>Per基因轉(zhuǎn)錄。這里需要用Occam剃刀原則，既首先用最簡(jiǎn)單的解釋，最簡(jiǎn)單的不能解釋才用更復(fù)雜的解釋。這一簡(jiǎn)單解釋提供了生物鐘機(jī)制的理論突破，是迄今為止仍被公認(rèn)的“轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋環(huán)路（transcription-translation feedback loop, TTFL）”的基礎(chǔ)。
不久，霍爾—羅斯巴希組又用抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Per蛋白質(zhì)的表達(dá)也有晝夜節(jié)律，這種節(jié)律的長(zhǎng)短也被Per基因所調(diào)節(jié)，因?yàn)?em>pers中，Per的蛋白質(zhì)晝夜周期也縮短（Zerr et al., 1990）。mRNA的晝夜節(jié)律與蛋白質(zhì)晝夜節(jié)律之間有一定的間隔，既相位不同。幾年之后知道不僅Per蛋白質(zhì)含量變化，而且其亞細(xì)胞定位變化：晝夜周期中，Per蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核的時(shí)間有晝夜周期變化（Curtin et al., 1995）。
11.9 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控
1990年，研究果蠅生物鐘的Hardin等提出Per蛋白質(zhì)可能調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，依據(jù)間接證據(jù)。如果這一假設(shè)正確，那么Per蛋白質(zhì)就是基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。而1980年代有很多轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展，為研究Per和生物鐘的機(jī)理提供很好的借鑒。1991年和1992年，其他途徑的研究發(fā)現(xiàn)促進(jìn)對(duì)Per的理解。果蠅的single minded（sim）基因控制果蠅胚胎腹側(cè)中線的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育（Nambu et al., 1990）。研究環(huán)境致癌物二惡英(dioxin)的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)編碼其受體Ah R的基因（Hoffman et al., 1991；Burbach et al., 1992）。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)Per、Ah R和Sim三個(gè)蛋白質(zhì)有相似的區(qū)域，稱為PAS區(qū)域。
從AhR是轉(zhuǎn)錄因子可以提示Per和SIM也是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，但Per與AhR的相似只在PAS區(qū)域而缺AhR所含專門(mén)結(jié)合DNA并調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的bHLH區(qū)域，所以Per是否調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄并不確定，如果調(diào)節(jié)，并不清楚是如何調(diào)節(jié)。1993年，羅斯巴希實(shí)驗(yàn)室的黃佐實(shí)證明，PAS區(qū)域是蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用區(qū)域，一個(gè)蛋白質(zhì)所含的PAS可以結(jié)合另一蛋白質(zhì)的PAS區(qū)域（Huang et al.，1993）。
進(jìn)一步研究提出，具有bHLH和PAS區(qū)域的蛋白質(zhì)可能是轉(zhuǎn)錄激活因子，而只有PAS、缺bHLH的Per蛋白質(zhì)不能激活轉(zhuǎn)錄但可能抑制轉(zhuǎn)錄（Lindebro et al.，1995）。Hardin自己獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室后，證明Per蛋白質(zhì)調(diào)控Per基因轉(zhuǎn)錄，依賴于Per基因在蛋白質(zhì)編碼區(qū)域之上游（分子生物學(xué)稱為5’端）的DNA序列（Hao et al., 1997）。以后有更多證據(jù)表明，Per參與調(diào)節(jié)多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄。
11.10 更多參與果蠅生物鐘的基因
影響生物鐘不可能只有一個(gè)基因。
1971年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)影響果蠅生物鐘的基因Per。1983年，Jackson發(fā)表了影響果蠅生物鐘的其他基因（Jackson，1983），但無(wú)果而終。1990年，霍爾—羅斯巴希組發(fā)表“新”的果蠅晝夜節(jié)律基因“鐘” （Clock）（Dushay et al., 1990），不過(guò)他們于1992年發(fā)現(xiàn)這不是新的基因而僅為Per基因的另一突變（Dushay et al., 1992），辛勤努力化為一江春水。
1991年Konopka 等發(fā)表第二個(gè)影響果蠅生物鐘的新基因Andante （Konopka et al.，1991）。注意這一基因的人不多，到2003年它才被Tufts大學(xué)的Jackson實(shí)驗(yàn)室所克隆（Akten et al., 2003）。
1991年洛克菲勒大學(xué)楊邁克實(shí)驗(yàn)室的博士后Amita Sehgal等在會(huì)議上報(bào)道她們篩選影響果蠅生物鐘的新基因（Sehgal et al., 1991）。
1994年，楊邁克實(shí)驗(yàn)室報(bào)道他們發(fā)現(xiàn)了Timeless基因（“無(wú)時(shí)間”，簡(jiǎn)稱Tim）：Seghal等通過(guò)篩選七千多個(gè)位于第二號(hào)和第三號(hào)染色體的突變種，找到第三個(gè)影響果蠅生物鐘的新基因（Seghal et al., 1994）。他們用了轉(zhuǎn)座子插入誘導(dǎo)突變，以利克隆基因。她們用于檢測(cè)生物鐘的首先也是羽化時(shí)間，而后用活動(dòng)的晝夜節(jié)律核實(shí)。楊邁克實(shí)驗(yàn)室很快克隆到Tim基因（Myers et al., 1995）。雖然預(yù)計(jì)的Tim蛋白質(zhì)序列看不出它是怎么作用的蛋白質(zhì)，但因?yàn)樗梢越Y(jié)合Per，那么估計(jì)也是轉(zhuǎn)錄因子。
Sehgal等還發(fā)現(xiàn)Tim的RNA表達(dá)量也呈晝夜節(jié)律，Tim的突變也影響Per的RNA晝夜變化（Sehgal et al., 1995）。楊邁克實(shí)驗(yàn)室的研究生Leslie Vosshall發(fā)現(xiàn)Tim影響Per蛋白質(zhì)出入細(xì)胞核（Vosshall et al., 1994）。Weitz實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)Tim蛋白質(zhì)與Per蛋白質(zhì)可以直接相互結(jié)合（Gekakis et al., 1995）。羅斯巴希實(shí)驗(yàn)室的研究生曾紅葵發(fā)現(xiàn)Tim與Per兩個(gè)蛋白質(zhì)的相互作用有晝夜節(jié)律，而光可以調(diào)節(jié)Tim蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而提供了光對(duì)生物鐘的調(diào)節(jié)的分子機(jī)理（Zeng et al., 1996）。
多種生物，從細(xì)菌、植物到包括人在內(nèi)的動(dòng)物，都有節(jié)律、有晝夜節(jié)律（Herzog，2007）。存在于多種生物的生物鐘，是否用同樣的分子？是否用同樣的機(jī)理？紅色面包霉的生物鐘基因Frequency （frq，“頻率” ）于1989年被克隆，當(dāng)時(shí)以為它與Per有部分序列相似（McClung et al.，1989），后來(lái)發(fā)現(xiàn)不相似。控制有些細(xì)菌生物鐘的基因也紛紛被克隆（如，Liu et al., 1995；Ishiura et al., 1998）。1995年，調(diào)節(jié)植物（如擬南芥）生物鐘的基因突變被發(fā)現(xiàn)（Millar et al., 1995）。1998年，調(diào)節(jié)植物生物鐘的基因被克?。╓ang and Tobin, 1998；Schaffer et al., 1998）。
那么：哺乳類的生物鐘，用什么基因？
11.11 千呼萬(wàn)喚始出來(lái)：哺乳動(dòng)物的生物鐘基因
調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物生物鐘的第一個(gè)基因tau的突變種于1988年被偶然發(fā)現(xiàn)（Ralph and Menaker，1988），但克隆這一基因需要等到2000年（Lowrey et al., 2000），它編碼一個(gè)蛋白激酶（CKIe）。
果蠅的Per基因在1984年被克隆后，長(zhǎng)期有人（如麻省大學(xué)伍斯特校區(qū)的Steven Reppert）試圖在高等動(dòng)物中找到Per基因，但費(fèi)九牛二虎之力而無(wú)果。曾找到了蠶的Per基因（Reppert et al., 1994），但它居然沒(méi)有幫助找哺乳類的Per。一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)基因在低等動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)后，在高等動(dòng)物中比較容易找到，有多種方法可以通過(guò)DNA序列相似性找到。找不到有幾種可能：Per在高等動(dòng)物不存在，例如果蠅可能與高等動(dòng)物的生物鐘不同，也可以是果蠅和高等動(dòng)物生物鐘大體類似但其中有分子不同（如果蠅用Per但高等動(dòng)物不用）；另一可能是研究者技術(shù)上的問(wèn)題，在高等動(dòng)物存在Per，但未被找到。從1984年到1997年都找不到哺乳動(dòng)物的Per的情況下，人們擔(dān)心哺乳類無(wú)Per基因，可能果蠅和高等動(dòng)物有不同的生物鐘。
時(shí)代呼喚英雄，找到哺乳類生物鐘基因的英雄。在美國(guó)芝加哥北郊西北大學(xué)工作的日裔科學(xué)家高橋（Joseph S Takahashi,1951-）決定不再依賴容易的方法，而用老鼠做遺傳篩選。
用老鼠做研究比果蠅要貴很多。如果通過(guò)篩選找基因，經(jīng)費(fèi)的問(wèn)題使絕大多數(shù)人望而卻步，所以很少科學(xué)家用老鼠進(jìn)行隨機(jī)基因突變后的篩選。為了在一定范圍省時(shí)間和經(jīng)費(fèi)，高橋?qū)嶒?yàn)室不篩選純合體突變種，而篩雜合體。不過(guò)篩雜合體雖省了工作量，但也降低了突變檢出率。即使這樣，篩一遍所有基因突變也需要超過(guò)十萬(wàn)只老鼠。有個(gè)笑話：做這種實(shí)驗(yàn)，需要在老鼠身上開(kāi)銷豪華旅館的經(jīng)費(fèi)。1994年世界上沒(méi)實(shí)驗(yàn)室敢做這類研究，擔(dān)心用完了經(jīng)費(fèi)還找不到影響老鼠生物鐘的基因。
高橋帶領(lǐng)實(shí)驗(yàn)室決定篩選，這是發(fā)憤圖強(qiáng)、還是鋌而走險(xiǎn)?
他們的勇氣為運(yùn)氣所迎接。
他們到1994年共篩選了304只小鼠，第25只就是影響生物鐘的突變體，他們將突變相應(yīng)的基因命名為“鐘” （Clock）（Vitaterna et al., 1994）。鼠生物鐘的正常周期是23.7小時(shí)，Clock突變雜合鼠晝夜節(jié)律為24.8，需要靈敏和可靠的檢測(cè)才能發(fā)現(xiàn)不大的變化。從雜合體檢測(cè)出小的、但可靠的變化后，高橋?qū)嶒?yàn)室很容易通過(guò)交配小鼠而獲得Clock基因突變的純合體，再檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：完全喪失晝夜節(jié)律。1997年，高橋?qū)嶒?yàn)室發(fā)表兩篇論文，報(bào)道他們克隆了小鼠Clock基因的DNA（King et al., 1997；Antoch et el., 1997）。
從基因序列可以推測(cè)Clock蛋白質(zhì)不僅含蛋白質(zhì)相互作用的PAS區(qū)域，且有直接結(jié)合DNA的bHLH區(qū)域（King et al., 1997），從而容易理解它如何調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。Clock基因本身也表達(dá)于SCN。
人、雞、蛙、魚(yú)、蜥蜴也有Clock基因（King et al., 1997），因此Clock是普適于生物鐘的基因，很可能是生物鐘的機(jī)理也是普適。
1997年，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室找到老鼠和人的Per （Tei et al., 1997；Sun et al., 1997）。美國(guó)華人科學(xué)家在研究其他問(wèn)題的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)一個(gè)基因與Per序列相似（Sun et al., 1997）。以前沒(méi)找到的原因是哺乳類與果蠅的Per基因在整個(gè)基因的相似性不很高，而局部序列相似性高。用整體去找很難，而用局部片段的困難在于以前并不知道用哪段才好。
哺乳類有三個(gè)Per基因：Per1、Per2、Per3（Shearman et al., 1997），Per基因表達(dá)在SCN（Shearman et al., 1997），其表達(dá)隨晝夜節(jié)律變化而變化，這一節(jié)律受Clock基因的調(diào)節(jié)(Jin et al., 1999)。
1998年，霍爾—羅斯巴希組通過(guò)遺傳篩選，在果蠅找到Jrk基因，測(cè)序后顯示它就是果蠅的Clock基因（Allada et al., 1998）。
Steve Kay實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)Clock蛋白可以激活帶有Per基因啟動(dòng)子片段E-box驅(qū)動(dòng)的熒光素報(bào)告基因的表達(dá)，這一激活能被Per自身所抑制，從而較好地實(shí)現(xiàn)負(fù)反饋環(huán)路的閉合（Darlington et al., 1998）。
首先在果蠅發(fā)現(xiàn)的Per基因終于在哺乳類找到了，而首先在老鼠發(fā)現(xiàn)的基因Clock也在果蠅中發(fā)現(xiàn)了，所以：從昆蟲(chóng)到哺乳類，生物鐘的基因高度保守?；蛩降谋Ｊ?，提示機(jī)理的相似。
鉆研果蠅生物鐘的科學(xué)家們就不用再擔(dān)心是自己怪癖，而確實(shí)是探討和揭示動(dòng)物普遍適用的機(jī)理。
11.12 遺傳篩選對(duì)生物鐘研究的重要性
在生物鐘的基因研究過(guò)程中，果蠅一馬當(dāng)先，科學(xué)家從中發(fā)現(xiàn)了Per（Konopka and Benzer，1971）、Andante（Konopka et al.，1991）、Tim（Sehgal et al., 1991, 1994）。
用果蠅研究生物鐘，在速度、價(jià)格、工作量上都優(yōu)于哺乳類。用細(xì)菌、真菌、植物研究生物鐘，也可以有這些優(yōu)勢(shì)，但（研究了以后才知道）它們的生物鐘基因不同于動(dòng)物的，研究它們不能揭示哺乳類的生物鐘機(jī)理。
當(dāng)然，在從各種生物得到答案之前，人們無(wú)法預(yù)料生物鐘的機(jī)理保守的范圍。但事后可以總結(jié)果蠅對(duì)于生物鐘研究的重要性。并非所有低等生物的研究都適用于高等生物，有些相通、有些不同。例如：細(xì)胞周期的原理從酵母到人都保守，而性別決定的機(jī)理從果蠅到人類并不保守。雖然研究低等生物特有的生物學(xué)原理也有科學(xué)意義，但人偏于關(guān)注對(duì)高等生物適用的分子和規(guī)律。
在發(fā)現(xiàn)Per、Andante、Tim等基因之后，科學(xué)家們還多次用果蠅繼續(xù)篩選影響生物鐘的基因?；魻枌?shí)驗(yàn)室用熒光素接在Per基因位點(diǎn)，用酶活性間接報(bào)告Per的轉(zhuǎn)錄情況（Brandes et al., 1996；Stanewsky et al., 1997； Plautz et al., 1997）。他們篩選了5137株影響熒光素表達(dá)的果蠅突變種，發(fā)現(xiàn)chryptochrome （cry）基因參與果蠅生物鐘（Stanewsky et al., 1998）。用果蠅的遺傳研究發(fā)現(xiàn)Cry的作用在于介導(dǎo)外界的光調(diào)節(jié)身體內(nèi)在的生物鐘（Stanewsky et al., 1998）。生物鐘在無(wú)外界環(huán)境影響的情況下，可以自行運(yùn)轉(zhuǎn)。在外界環(huán)境作用下，生物鐘與外界相配合。雖然其他如聲音、溫度、進(jìn)食也可影響生物鐘，外界的光當(dāng)然是調(diào)節(jié)生物鐘的關(guān)鍵因素之一，Cry功能的發(fā)現(xiàn)解決了一個(gè)重要的問(wèn)題。這里也可以看到，遺傳篩選不僅為了找到基因，而且有時(shí)可能從基因編碼的蛋白質(zhì)推測(cè)出分子機(jī)理。Cry本身的mRNA表達(dá)也有晝夜節(jié)律，它也調(diào)節(jié)Per和Tim表達(dá)與光的關(guān)系（Emery et al., 1998；Stanewsky et al., 1998）。果蠅有4套染色體。羅斯巴希-霍爾合作篩選第三號(hào)染色體，用化學(xué)誘變得到遺傳突變種，篩選了6千多種以后，發(fā)現(xiàn)Jrk基因（Allada et al., 1998）。他們發(fā)現(xiàn)的影響果蠅節(jié)律的Cycle基因，也有小鼠的類似基因Bmal（Rutila et al., 1998）。所以，通用多個(gè)基因證明從昆蟲(chóng)到哺乳類用同樣的分子調(diào)節(jié)生物鐘。楊邁克實(shí)驗(yàn)室在果蠅的第2和第3號(hào)染色體篩選了多于1萬(wàn)5千種突變，發(fā)現(xiàn)了他們命名為Doubletime的基因，而它編碼了酪蛋白激酶e（CKIe）（Price et al., 1998）。它可以調(diào)節(jié)Per蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。高橋?qū)嶒?yàn)室于2000年克隆了金倉(cāng)鼠的tau基因，發(fā)現(xiàn)原來(lái)也是CKIe（Lowrey et al., 2000）。開(kāi)始研究蛋白激酶導(dǎo)致磷酸化、磷酸化調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。到2001年，已知多個(gè)基因在果蠅和小鼠都調(diào)節(jié)生物鐘：包括果蠅的一個(gè)Per和小鼠的三個(gè)Per基因、果蠅的一個(gè)Cry和小鼠的兩個(gè)Cry、果蠅的Jrk和小鼠的Clock和Npas2、果蠅的Cycle和小鼠的Bmal1、果蠅的Doubletime和小鼠的CKId和CKIe基因（Reppert and Weaver, 2001）。
11.13 篩選生物鐘相關(guān)基因的其他途徑
在完全不理解分子機(jī)理的情況下，用遺傳篩選生物鐘相關(guān)的基因是很有效的方法，未嘗不可稱之為“盲篩”。盲篩的優(yōu)點(diǎn)在于無(wú)需事先知道機(jī)理，而通過(guò)遺傳得到突變、在通過(guò)克隆DNA得到序列、序列特征揭示所編碼蛋白質(zhì)、所編碼蛋白質(zhì)如果與現(xiàn)有蛋白質(zhì)有序列相似性可以提示功能，有了功能很有可能再揭示機(jī)理。這是一些人所謂的“遺傳學(xué)的令人敬畏的力量” （the awesome power of genetics）。這一途徑被用于多個(gè)重要問(wèn)題的研究，生物鐘是早期的研究對(duì)象之一。
當(dāng)然，遺傳學(xué)并非唯一途徑。早在1995年，哈佛醫(yī)學(xué)院Weitz實(shí)驗(yàn)室的Gekakis等通過(guò)Per蛋白質(zhì)尋找與Per直接相互作用的蛋白質(zhì)，找到Tim蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)Tim與Per兩個(gè)蛋白質(zhì)直接結(jié)合（Gekakis et al., 1995）。尋找相互作用的蛋白質(zhì)，理論上可以用生物化學(xué)的途徑，也可以用當(dāng)時(shí)誕生不久的酵母雙雜交（Y2H）方法，在酵母細(xì)胞中，構(gòu)建分子探針，尋找文庫(kù)中與之相互結(jié)合的蛋白質(zhì)。Weitz用Y2H發(fā)現(xiàn)Tim與同期楊邁克實(shí)驗(yàn)室用果蠅遺傳篩選發(fā)現(xiàn)Tim有異曲同工之妙。
因?yàn)镻er（和Tim）的RNA有晝夜節(jié)律，提示也可以專門(mén)找其RNA有晝夜節(jié)律的基因，其中也會(huì)有參與生物鐘的基因（例如：Abruzzi et al., 2017），而不都是生物鐘的結(jié)果。后來(lái)知道蛋白激酶參與生物鐘，也就可以專門(mén)找其磷酸化有晝夜變化的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)之后進(jìn)行基因突變以檢測(cè)是否參與生物鐘。
當(dāng)技術(shù)發(fā)展，如分子生物學(xué)的RNAi（RNA干擾）技術(shù)等之后，也自然可以用新技術(shù)研究老問(wèn)題。2009年，美國(guó)圣地亞哥加州大學(xué)Steve Kay實(shí)驗(yàn)室的博士后張二荃用RNAi篩選生物鐘的基因。他利用當(dāng)時(shí)已知多種細(xì)胞有生物鐘，而設(shè)計(jì)在體外培養(yǎng)的人類細(xì)胞用Per基因插入熒光素基因，通過(guò)熒光素基因的表達(dá)周期顯示生物鐘。在這樣的細(xì)胞中，引入不同的RNAi，張二荃因此找到影響人類生物鐘的基因（Zhang et al., 2009）。有了CRISPR-CAS9技術(shù)后，也可以用于生物鐘研究。
從1971年的果蠅篩選到2009年人的篩選，研究的時(shí)間跨度很大，但基因并沒(méi)有找全。果蠅的篩選就沒(méi)有篩完，而是每次都有局限，哺乳動(dòng)物的篩選更沒(méi)有完。如果以后有更多、更好的途徑和方法，包括已用過(guò)但未充分使用的方法，再發(fā)現(xiàn)影響生物鐘的基因，不會(huì)令人驚訝。
11.14 生物鐘的分子和細(xì)胞機(jī)理
發(fā)現(xiàn)基因固然重要。但生物學(xué)基礎(chǔ)研究的目的是闡明機(jī)理。
綜合多年的研究結(jié)果，可以看到，Per調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，是分子機(jī)理的突破。簡(jiǎn)而言之，Clock和Cycle蛋白質(zhì)組成復(fù)合體，直接刺激一些下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，這些靶基因進(jìn)一步控制生物鐘。而Per和Tim蛋白復(fù)合體抑制Clock和Cycle的作用。Per基因和Tim基因本身還是Clock和Cycle的靶基因，從而組成轉(zhuǎn)錄負(fù)反饋環(huán)。Per蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性被磷酸化所調(diào)節(jié)，也就被Doubletime或CK1?和?等蛋白激酶和去除磷酸化的蛋白磷酸酶所調(diào)節(jié)（Wijnen and Young，2006；Benito et al., 2007）。Per和Clock蛋白質(zhì)可以被糖基化修飾，并因此被調(diào)節(jié)。Cry介導(dǎo)光調(diào)節(jié)Tim/Per的穩(wěn)定性。在Clock/Cycle和Per/Tim參與的主要轉(zhuǎn)錄環(huán)之外，還有其他轉(zhuǎn)錄環(huán)，有其他基因如pdp1、vri、RORa和REV-ERB?參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
Per和Tim蛋白質(zhì)不僅有穩(wěn)定性的問(wèn)題，還有亞細(xì)胞定位問(wèn)題：在細(xì)胞漿、還是細(xì)胞核。作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它們只有在進(jìn)入細(xì)胞核才能見(jiàn)到基因調(diào)節(jié)的機(jī)器，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄（Siepka et al., 2007；Dubowy and Sehgal，2017）。Per和Tim的mRNA在白天逐漸升高，到傍晚達(dá)最高峰。兩個(gè)蛋白質(zhì)的合成晚于其mRNA幾小時(shí)后逐漸積累，先在細(xì)胞漿，午夜進(jìn)入細(xì)胞核。Tim蛋白質(zhì)既在細(xì)胞漿內(nèi)穩(wěn)定Per蛋白質(zhì)，也促進(jìn)Per進(jìn)入細(xì)胞核（Meyer, Saez and Young，2006）。
有趣的是，雖然細(xì)菌、真菌、和植物分別由其他分子組成生物鐘，其分子也是通過(guò)正反饋和負(fù)反饋來(lái)實(shí)現(xiàn)振蕩。外界的光或其它因素通過(guò)一定方式影響它們的生物鐘也用了轉(zhuǎn)錄調(diào)控、和磷酸化調(diào)節(jié)等（綜述見(jiàn)Wijnen and Young，2006）。植物的生物鐘也用了細(xì)胞漿和細(xì)胞質(zhì)定位的調(diào)節(jié)（Wang and Tobin，1998；Mas，2008）。從細(xì)菌到人不同生物的生物鐘雖然分子不同，但原理有共同性。
在細(xì)胞層面，動(dòng)物體內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞（甚至所有細(xì)胞）都有生物鐘（Emery et al., 1997；Giebultowicz and Hege，1997；Plautz et al., 1997）。果蠅的翅膀切下后依然可以觀察到其中的生物鐘影響(Plautz et al., 1997)，人的細(xì)胞體外培養(yǎng)也表現(xiàn)出代謝上的節(jié)律（Balsalobe et al., 1998）。
在果蠅腦內(nèi)大約150個(gè)表達(dá)Per和Tim基因的神經(jīng)細(xì)胞組成主鐘。Konopka和Benzer在1971年的文章就指出，突變基因起作用的解剖部位很重要。也就是說(shuō)如果能夠找到這些細(xì)胞，就可能找到主生物鐘。一般推測(cè)果蠅腦含約10萬(wàn)個(gè)神經(jīng)細(xì)胞，而其中150個(gè)細(xì)胞是主生物鐘，推測(cè)是依據(jù)Per和Tim的功能和基因表達(dá)部位（Konopka and Benzer,1971；Vosshall and Young, 1995；Kaneko，Helfrich-Forster, Hall，1997；Panda，Hogenesch and Kay，2002；Helfrich-Forster, 2005）。它們包括：背側(cè)的神經(jīng)元DN1、DN2、DN3，側(cè)后神經(jīng)元LPNs，側(cè)面偏背神經(jīng)元LNd、側(cè)面偏腹小神經(jīng)元sLNvs、側(cè)面偏腹大神經(jīng)元lLNvs。其中l(wèi)LNvs神經(jīng)元全部含PDF神經(jīng)肽，而5個(gè)sLNvs中4個(gè)含PDF（Nitabach and Taghert，2008）。PDF在生物鐘也起重要作用（Renn et al., 1999）。這些細(xì)胞的功能也不一樣，含PDF的sLNvs細(xì)胞為控制果蠅早上活動(dòng)的早晨細(xì)胞，而LNd和不含PDF的sLNvs細(xì)胞為控制果蠅傍晚活動(dòng)的傍晚細(xì)胞。
人的主鐘SCN含約5萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，小鼠SCN含約兩萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。哺乳動(dòng)物主鐘內(nèi)部也有分工和協(xié)調(diào)。SCN的神經(jīng)細(xì)胞分離的狀態(tài)下，分別有節(jié)律但不同步，而它們?cè)谝黄饡r(shí)節(jié)律同步，有神經(jīng)肽等分子參與，有神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。
11.15 人的生物鐘相關(guān)基因
科學(xué)較晚理解人的生物鐘，而其中遺傳和基因分析也起了突破性的作用。
用8753對(duì)成年雙胞胎的研究表明：人的晝夜節(jié)律有很強(qiáng)的遺傳性（Koskenvuo et al., 2007）。
1999年，通過(guò)人類遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)三家生物鐘節(jié)律加快的家系，稱為（家族性睡眠相位提前綜合征，F(xiàn)ASPS），表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳（Jones et al., 1999）。2001年，當(dāng)時(shí)在Utah大學(xué)的Ptá?ek和Fu兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室合作發(fā)現(xiàn)，人的Per2基因（hPer2）與人的生物鐘相關(guān)。他們研究的一家FASPS，每天早上4點(diǎn)半醒，晚上7點(diǎn)半睡，相位比一般人提前4小時(shí)。Ptá?ek和Fu的遺傳分析發(fā)現(xiàn)，該家系成員凡有hPer2編碼的特定位點(diǎn)變化者發(fā)生相位提前，凡這個(gè)位點(diǎn)正常者無(wú)相位提前問(wèn)題（Toh et al., 2001）?；蜃兓瘜?duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)序列的662位氨基酸，正常是絲氨酸（簡(jiǎn)稱S）。因?yàn)镾可以被磷酸化，他們當(dāng)時(shí)以為S662是由CKI?所磷酸化（Toh et al., 2001）。2005年在Ptá?ek和Fu實(shí)驗(yàn)室工作的徐瓔發(fā)現(xiàn)CKI?基因突變也能在人和小鼠導(dǎo)致相位提前（Xu et al., 2005）。
還有其他基因參與人的生物鐘（He et al., 2009）。楊邁克實(shí)驗(yàn)室于2017年發(fā)現(xiàn)人的Cry1基因突變可以導(dǎo)致生物鐘相位推遲（晚睡晚起）（Patke et al., 2017）。
11.16 生物鐘小結(jié)
生物鐘遺傳研究確實(shí)有運(yùn)氣，但也有勇氣。
運(yùn)氣，外在而縹緲；勇氣，內(nèi)生而實(shí)在。在用遺傳學(xué)研究生物鐘的過(guò)程中，事先難以預(yù)料能否取得突破，事后分析發(fā)現(xiàn)勇氣足以成功、而運(yùn)氣是錦上添花，雖然花開(kāi)的特別燦爛。生物鐘的研究有幾次看上去非常有運(yùn)氣，但仔細(xì)分析發(fā)現(xiàn)勇氣更重要。在看不清前途時(shí)默默探索，在一個(gè)小領(lǐng)域內(nèi)長(zhǎng)期耕耘；遇困難出差錯(cuò)恐在所難免，碰運(yùn)氣獲機(jī)遇也時(shí)有所得。粗看似乎運(yùn)氣重要，細(xì)看可見(jiàn)勇氣更重要：勇于做前人沒(méi)做過(guò)、旁人沒(méi)想過(guò)、偉人不相信的工作。
Konopka和Benzer從一千九百多品系果蠅中篩到三只突變果蠅，竟然是同一個(gè)基因的三個(gè)影響完全不一樣的突變。遺傳學(xué)研究的歷史上可能只有這一次，生物學(xué)歷史可能也只有這一次。如果沒(méi)有這樣的突變，可能還有些人會(huì)比較猶豫生物鐘能否用遺傳學(xué)進(jìn)行研究，因當(dāng)時(shí)很容易設(shè)想一些在果蠅生物鐘篩選方法中有表型，但不一定反映生物鐘核心機(jī)構(gòu)的基因。表型能否可靠并直接地幫助遺傳學(xué)家研究核心問(wèn)題，是非常重要的問(wèn)題。果蠅生物鐘的表型，幾十年后的今天看來(lái)非?？煽浚?dāng)初并不清楚。正如今天問(wèn)：從果蠅檢測(cè)的睡眠，是否真是睡眠？很多人，包括研究果蠅的科學(xué)家，今天也不敢清晰地回答這一問(wèn)題。
高橋?qū)嶒?yàn)室在老鼠的篩選過(guò)程中，第25只老鼠就是影響生物鐘的突變，也有很大的運(yùn)氣。如果沒(méi)這樣的運(yùn)氣，就要花很多的時(shí)間，很多研究，缺乏資源就難以支撐足夠力量。一般人預(yù)計(jì)成本后就不敢做這樣的研究。具有諷刺意味的是，后來(lái)高橋得到很大經(jīng)費(fèi)專門(mén)篩選小鼠，卻很不成功，錢(qián)的作用有時(shí)很奇怪。
我們可以事后諸葛亮，總結(jié)多個(gè)實(shí)驗(yàn)以后而意識(shí)到：實(shí)際上只要做足夠的篩選，不是篩兩千只果蠅，而是篩兩萬(wàn)只果蠅，一定能找到生物鐘的突變。雖不會(huì)得到一個(gè)基因的三種不同方向的突變，但同樣可能帶來(lái)突破。多次篩選果蠅生物鐘突變種，只有兩次比較倒霉，一次是重復(fù)發(fā)現(xiàn)以前的基因、一次搞錯(cuò)了，其他每次篩選都找到基因，而且是新基因。
高橋?qū)嶒?yàn)室用老鼠篩選生物鐘突變基因，也有運(yùn)氣。但事后看來(lái)，篩選超過(guò)幾千只就應(yīng)該能得到影響生物鐘的基因。而幾千只老鼠的經(jīng)費(fèi)，并非只有高橋?qū)嶒?yàn)室才有。對(duì)這一經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)并非徒勞，原在美國(guó)西南醫(yī)學(xué)中心、現(xiàn)在日本筑波國(guó)際睡眠醫(yī)學(xué)研究所的Masashi Yanagisawa及其團(tuán)隊(duì)，就用較大經(jīng)費(fèi)專門(mén)篩選小鼠睡眠的突變種，找到影響小鼠睡眠的基因（Funato et al., 2016）。
Konopka在研究過(guò)程中遇到了生物學(xué)史上空前絕后的運(yùn)氣，但個(gè)人際遇卻相當(dāng)不好。他畢業(yè)后到斯坦福大學(xué)做過(guò)短暫博士后，1974年回加州理工任助理教授，但評(píng)終身教授時(shí)未通過(guò)。他到Clarkson大學(xué)任教，再次未獲終身教授，1990年回到加州輔導(dǎo)高中生，2015年因心臟病去世（Rosbash，2015）。
而高橋在第一次成功地篩選到Clock之后，獲得很多經(jīng)費(fèi)支持進(jìn)行大規(guī)模篩選，卻未獲進(jìn)一步突破。居然在篩選小鼠生物鐘的突變這一實(shí)驗(yàn)，出現(xiàn)經(jīng)費(fèi)投入量與工作成就的負(fù)相關(guān)。高橋在生物鐘方面還有篩選之外的其他研究。
今天，有關(guān)生物鐘的重要問(wèn)題并未全部解決。
主鐘細(xì)胞內(nèi)的基因恐怕沒(méi)有窮盡，而是還有。已發(fā)現(xiàn)的參與生物鐘的基因，其機(jī)理并非完全清晰。主鐘的細(xì)胞間如何相互作用?已知SCN的幾萬(wàn)個(gè)細(xì)胞在一起的時(shí)候是同步的，而它們分開(kāi)后繼續(xù)有節(jié)律、但不同步。神經(jīng)肽參與其同步，是否還有其他機(jī)理? 只是神經(jīng)細(xì)胞參與生物鐘，還是有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞參與（Brancaccio et al., 2017；Tso et al., 2017）? 環(huán)路如何構(gòu)建? 中樞主鐘如何調(diào)節(jié)外周鐘。生物鐘與代謝、代謝疾病的關(guān)系及其機(jī)理，也沒(méi)有完全理解（Turek et al., 2005；Lamia et al., 2008; Marcheva et al., 2010；Robles, Humphrey and Mann，2017）。了解參與生物鐘蛋白質(zhì)，能否構(gòu)建很好的數(shù)學(xué)模型，在定性的基礎(chǔ)上邁進(jìn)定量的時(shí)代? 非24小時(shí)的其他節(jié)律，它們的機(jī)理是什么?
現(xiàn)代社會(huì)對(duì)于調(diào)節(jié)時(shí)差有較大需求。各種值班導(dǎo)致歐美近六分之一的上班族需要調(diào)時(shí)差，而且人類跨時(shí)區(qū)旅行量每年數(shù)以億計(jì)，老年人睡眠問(wèn)題相當(dāng)部分是生物鐘異常所致，所以調(diào)節(jié)時(shí)差對(duì)于工作效率和生活質(zhì)量都很重要。但生物鐘研究迄今沒(méi)拿出調(diào)節(jié)時(shí)差的藥物。
理論上與生物鐘相關(guān)的問(wèn)題中最重要的，是睡眠。理解生物鐘可以解釋睡眠的相位（何時(shí)睡），但不能解釋睡眠本身。睡眠的機(jī)理目前理解很少。教科書(shū)中睡眠的內(nèi)容相當(dāng)大部分是腦電圖的描繪，是現(xiàn)象的描述不是機(jī)理的理解。睡眠研究任重道遠(yuǎn)。Orexin及其受體的研究曾被認(rèn)為是突破，但帶來(lái)的進(jìn)展有限。而2016年柳沢正史（Masashi Yanagisawa）及其合作者發(fā)現(xiàn)的Sik3基因，是否是睡眠分子機(jī)理的關(guān)鍵突破，尚有待觀察。
注1：巴甫洛夫因研究消化系統(tǒng)而獲1904年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。Lorenz、von Frisch和 Tinbergen獲1973年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。Hartwell因?yàn)橛眠z傳篩選調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的基因獲2001年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。Max Delbrück因?yàn)檠芯渴删w獲1969年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。
注2：John Watson的研究有爭(zhēng)議，從一例先天智力障礙的患者得出結(jié)論能否推廣，另有倫理問(wèn)題（用小孩做干涉性實(shí)驗(yàn)如何消除對(duì)小孩的不良影響）。
注3：雖然只有動(dòng)物有視覺(jué)，但動(dòng)物和植物（以及有些細(xì)菌）都有感光系統(tǒng)，而動(dòng)物植物分別用一些分子感光，但只有Cry蛋白質(zhì)是動(dòng)植物都用于感光的分子。這本來(lái)也是研究Cry是否參與晝夜節(jié)律的一個(gè)原因，但奇怪的是，后來(lái)的實(shí)驗(yàn)表明參與晝夜節(jié)律的Cry并不能感光，現(xiàn)在Cry的作用機(jī)理不明。
注4：Benzer逝世于2007年，Konopka逝世于2015年。楊邁克、霍爾和羅斯巴希獲2017年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。
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