【摘要】 目的:研究叉頭框蛋白O3a(forkhead box protein O3a,F(xiàn)oxO3a)下調(diào)對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響和機(jī)制。方法:體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞,10 ng/mL TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞建立EMT細(xì)胞模型,Western blot檢測(cè)E-cadherin、α-SMA表達(dá),證明細(xì)胞EMT模型建立成功。Western blot檢測(cè)在EMT細(xì)胞和正常細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a的表達(dá)變化。敲低正常HK-2細(xì)胞中的FoxO3a后,Western blot檢測(cè)細(xì)胞的EMT程度。Western blot檢測(cè)EMT細(xì)胞與低表達(dá)FoxO3a細(xì)胞中β-Catenin的表達(dá)變化。結(jié)果:TGF-β1處理HK-2細(xì)胞作用后E-cadherin表達(dá)量顯著減少(P<><><><><><><0.01)。結(jié)論:hk-2細(xì)胞通過(guò)降低轉(zhuǎn)錄因子foxo3a的表達(dá),從而上調(diào)β-catenin,促進(jìn)細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。>0.01)。結(jié)論:hk-2細(xì)胞通過(guò)降低轉(zhuǎn)錄因子foxo3a的表達(dá),從而上調(diào)β-catenin,促進(jìn)細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。>
【關(guān)鍵詞】 腎小管上皮細(xì)胞; FoxO3a; β-Catenin; 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化
【Abstract】 Objective:To explore the effect and mechanism of forkhead box proteinO3a knocking down on the epithelial-to-mesenchymal transition of HK-2 human renal proximal tubular cells.Method:HK-2 cells cultured in vitro,10 ng/mL TGF-β1 induced EMT of HK-2 cells,The expression levels of E-cadherin,α-SMA were determined by Western blot and immunofluorescence assay.The expression of FoxO3a in EMT of HK-2 cells and HK-2 cells were determined by Western blot.Knocking down FoxO3a in the HK-2 cells,the levels of EMT marker proteins were determined by Western blot.The expression level of β-catenin in the EMT of HK-2 cells and low expression FoxO3a of the cells were determined by Western blot.Result:Compared with HK-2 cells incubated with free TGF-β1,the protein expression of E-cadherin significantly decreased(P<0.01),and the="" expression="" levels="" ofα-sma="" markedly="" increased="" in="" hk-2="">0.01),and><0.05).the expression="" levels="" of="" foxo3a="" markedly="">0.05).the><0.01)in hk-2="" cells="" by="" the="" inducement="" of="" tgf-β1.in="" knocking="" down="" foxo3a="" of="" hk-2="" cells,the="" protein="" expression="" of="" e-cadherin="" significantly="">0.01)in><0.01),and α-sma="" markedly="" increased.the="" expression="" level="" of="" β-catenin="" in="" the="" emt="" of="" hk-2="" cells="" and="" low="" expression="" foxo3a="" of="" the="" cells="" significantly="" increased="" by="" western="" blot.conclusion:down-regulation="" of="" foxo3a="" could="" promote="" emt="" of="" human="" renal="" proximal="" tubular="" epithelial="" cells="" by="" increasing="" the="" expression="" levels="" of="" β-catenin.="">0.01),and>
【Key words】 Renal proximal tubular cells; FoxO3a; β-Catenin; Epithelial to mesenchymal transition
First-author’s address:School of Basic Medical Sciences,Shanxi Medical University,Taiyuan 030000,China
doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2017.13.010
慢性?I臟疾病(chronic kidney disease,CKD)由于其發(fā)病率高以及增加發(fā)生晚期腎臟疾病和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn),極大地威脅到人類健康[1]。纖維化是所有慢性腎臟疾病的典型性特征,其是因多種病理性因素造成腎臟損傷后,持續(xù)的炎癥反應(yīng)使得多種促纖維化細(xì)胞因子及血管活性物質(zhì)表達(dá)增加,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)在腎臟間質(zhì)性腔隙的過(guò)度沉積而形成瘢痕[2]。腎實(shí)質(zhì)主要由腎小管上皮細(xì)胞組成,腎臟損傷后極易受到影響,所以腎小管上皮細(xì)胞受損被認(rèn)為是進(jìn)行性腎臟疾病的主要過(guò)程。受損的腎小管細(xì)胞通過(guò)失去上皮標(biāo)記物和獲得間質(zhì)標(biāo)記物的過(guò)程,完成上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)增加了腎臟肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量[3]。腎臟肌成纖維細(xì)胞的一種活性形式是α-平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性肌成纖維細(xì)胞,這種細(xì)胞被廣泛認(rèn)為是在腎纖維化中產(chǎn)生基質(zhì)的主要細(xì)胞類型。叉頭框蛋白(forkhead box protein,F(xiàn)OX)家族是調(diào)控纖維化的重要轉(zhuǎn)錄因子,其重要成員叉頭框蛋白O3a(forkhead box proteinO3a, FoxO3a)可以通過(guò)抑制β-Catenin的表達(dá),從而達(dá)到抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化[4-7]。誘導(dǎo)上皮細(xì)胞EMT過(guò)程中,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)是其中重要的誘導(dǎo)因子[8]。于是本文章通過(guò)TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞建立EMT模型,觀察FoxO3a轉(zhuǎn)錄因子是否與人腎小管細(xì)胞EMT過(guò)程有關(guān),并且檢測(cè)正常細(xì)胞低表達(dá)FoxO3a后,細(xì)胞EMT的程度。研究細(xì)胞EMT后,β-Catenin的表達(dá)變化是否與細(xì)胞低表達(dá)FoxO3a后一致,從而探討在腎臟細(xì)胞中FoxO3a是否通過(guò)β-Catenin調(diào)節(jié)對(duì)細(xì)胞EMT產(chǎn)生的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。 1 材料與方法
1.1 主要材料和試劑 人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院);Recombinant Human TGF-β1(PEPROTECH);DMEM/F12(HyClone);胎牛血清(Scien Cell);FoxO3a-siRNA、Control-siRNA、FoxO3a抗體、E-cadherin抗體、β-Catenin抗體(Cell Signaling);α-SMA抗體(Abcam)鼠抗GAPDH抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋);CY3-羊抗兔IgG(博士德生物)。Lipofectamine RNAiMAX (invitrogen)。
1.2 HK-2細(xì)胞培養(yǎng) 配制含有10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM/F12完全培養(yǎng)基,將細(xì)胞置于5% CO2、37 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)。使用0.05%的胰酶含EDTA進(jìn)行傳代,每3~4天傳代一次。待細(xì)胞的融合率達(dá)到20%~30%,無(wú)血清培養(yǎng)12 h,將細(xì)胞分為對(duì)照組(Control)和給藥組(Treated)。對(duì)照組(-)繼續(xù)無(wú)血清培養(yǎng),給藥組(+)加入濃度為10 ng/mL TGF-β1的無(wú)血清培養(yǎng)基,培養(yǎng)72~96 h后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.3 細(xì)胞總蛋白的提取和Western blot檢測(cè) 每孔加入RIPA裂解液(碧云天)70 μL,將細(xì)胞置于冰上裂解30 min后,收集細(xì)胞裂解液到EP管中,4 ℃ 12 000 r/min離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管作為細(xì)胞蛋白樣品,用BCA法測(cè)總蛋白濃度,蛋白樣品100 ℃變性10 min進(jìn)行電泳,每次上樣量為60 μg。使用10%的十二烷基硫酸鈉?C聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳,電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上。5%的脫脂奶粉在室溫下封閉2 h。一抗孵育4 ℃搖床過(guò)夜,一抗?jié)舛葹镋-Cadherin(1∶1000)、α-SMA(1∶1000)、FoxO3a(1∶1000)、β-Catenin(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)。洗膜。用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗(1∶5000)稀釋液室溫孵育1.5 h,洗膜,化學(xué)發(fā)光法ECL法顯色。使用Image J軟件對(duì)Western條帶灰度進(jìn)行定量分析,以GAPDH為內(nèi)參。
1.4 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 待正常HK-2細(xì)胞融合率達(dá)40%~50%,棄去細(xì)胞培養(yǎng)基,PBS沖洗2次。六孔板每孔加2 mL無(wú)血清培養(yǎng)基,把稀釋的Lipofectamine RNAiMAX和稀釋的FoxO3a-siRNA及Control-siRNA混勻靜置20 min。將Control-siRNA-Lipofectamine RNAiMAX 混合液加入細(xì)胞為NC組,F(xiàn)oxO3a-siRNA-Lipofectamine RNAiMAX混合液加入孔中為siRNA組。培養(yǎng)6 h后,加藥誘導(dǎo)72 h,收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料用(x±s)表示,比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。>0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。>
2 結(jié)果
2.1 TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞產(chǎn)生EMT后FoxO3a表達(dá)量情況 HK-2細(xì)胞中,10 ng/mL TGF-β1作用72 h后,Western blot檢測(cè)上皮標(biāo)記物E-Cadherin表達(dá)降低(P<><><0.01),提示foxo3a與hk-2細(xì)胞emt過(guò)程有關(guān),見表1與圖1。>0.01),提示foxo3a與hk-2細(xì)胞emt過(guò)程有關(guān),見表1與圖1。>
2.2 敲低FoxO3a后對(duì)細(xì)胞EMT程度的影響 將FoxO3a-siRNA轉(zhuǎn)入HK-2細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染72 h后Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的FoxO3a蛋白水平的表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染FoxO3a-siRNA后細(xì)胞內(nèi)的FoxO3a蛋白含量顯著降低(P<><><0.05),證明敲低轉(zhuǎn)錄因子foxo3a后,可促進(jìn)hk-2細(xì)胞的emt,進(jìn)一步證實(shí)foxo3a與hk-2細(xì)胞emt過(guò)程有關(guān),見圖2。>0.05),證明敲低轉(zhuǎn)錄因子foxo3a后,可促進(jìn)hk-2細(xì)胞的emt,進(jìn)一步證實(shí)foxo3a與hk-2細(xì)胞emt過(guò)程有關(guān),見圖2。>
2.3 FoxO3a調(diào)控HK-2細(xì)胞EMT的可能機(jī)制 Western blot結(jié)果顯示:EMT細(xì)胞中AKT通路關(guān)鍵分子β-Catenin表達(dá)量增高(P<0.05);而在敲低foxo3a的>0.05);而在敲低foxo3a的><0.01),在emt細(xì)胞和低表達(dá)foxo3a細(xì)胞中β-catenin表達(dá)變化一致,說(shuō)明當(dāng)細(xì)胞中foxo3a減少時(shí),可能通過(guò)增加β-catenin表達(dá),促進(jìn)hk-2細(xì)胞emt。control組tgf-β1誘導(dǎo)及敲低foxo3a對(duì)hk-2細(xì)胞表達(dá)β-catenin為(0.66±0.03),treated組為(0.83±0.02),nc組為(0.24±0.07)sirna組為(0.58±0.01),見圖3。>0.01),在emt細(xì)胞和低表達(dá)foxo3a細(xì)胞中β-catenin表達(dá)變化一致,說(shuō)明當(dāng)細(xì)胞中foxo3a減少時(shí),可能通過(guò)增加β-catenin表達(dá),促進(jìn)hk-2細(xì)胞emt。control組tgf-β1誘導(dǎo)及敲低foxo3a對(duì)hk-2細(xì)胞表達(dá)β-catenin為(0.66±0.03),treated組為(0.83±0.02),nc組為(0.24±0.07)sirna組為(0.58±0.01),見圖3。>
3 討論
纖維化是所有慢性腎臟疾病的主要特征,而腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT是腎臟發(fā)生纖維化的重要原因[9]。EMT過(guò)程對(duì)于腎臟損傷后的腎小管功能障礙和促進(jìn)纖維化的發(fā)展都是重要且必需的。通過(guò)敲除Snail和Twist這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子等手段抑制EMT過(guò)程,能夠保護(hù)腎小管細(xì)胞的完整性和功能,恢復(fù)腎小管的修?禿馱偕?能力,并減少肌成纖維細(xì)胞的堆積,減輕多種慢性腎臟疾病模型的間質(zhì)性纖維化[10]。FOXO轉(zhuǎn)錄因子包括FoxO1,F(xiàn)oxO3a,F(xiàn)oxO4和FoxO6。其中FoxO3a又名橫紋肌肉瘤樣1叉頭框(forkhead rhabdomyosar-coma-like 1,F(xiàn)KHRL1),在人類基因中位于6號(hào)染色體(6q21)。FoxO3a不僅在細(xì)胞的增殖、凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)、衰老等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,而且通過(guò)與其它轉(zhuǎn)錄因子的相互影響,整合不同信號(hào),參與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的調(diào)控[11]。最近有研究表明用藥物增加FoxO3a的活性,可以抑制肺纖維化小鼠的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化[5]。本研究發(fā)現(xiàn),敲低FoxO3a后,HK-2細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵指標(biāo)E-Cadherin蛋白含量明顯減少,而α-SMA蛋白含量與NC組相比顯著增加。說(shuō)明FoxO3a對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞的EMT過(guò)程有調(diào)控作用。 β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是細(xì)胞膜上鈣黏蛋白復(fù)合物的主要組成成分,參與Wnt/β-catenin、TGF-β通路、NF-κB通路等多條信號(hào)通路。研究報(bào)道:TGF-β1可以誘導(dǎo)小管上皮細(xì)胞在細(xì)胞核中積累β-Catenin,β-Catenin作用于Wnt通路下游基因可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生EMT過(guò)程,當(dāng)敲低β-Catenin,能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)EMT過(guò)程[12]。近來(lái)發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a可以調(diào)控β-Catenin的表達(dá),參與癌細(xì)胞EMT的細(xì)胞通路,但具體機(jī)制仍未弄清[7]。本文發(fā)現(xiàn)HK-2細(xì)胞下調(diào)FoxO3a后,不僅EMT程度加深,且β-Catenin含量也增加。FoxO3a調(diào)節(jié)HK-2細(xì)胞EMT的機(jī)制可能與β-Catenin有關(guān)。綜上所述,在HK-2細(xì)胞中,F(xiàn)oxO3a可能通過(guò)調(diào)控β-Catenin蛋白含量,促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞EMT。
但是FoxO3a抑制腎臟纖維化的研究還不充分。過(guò)表達(dá)FoxO3a,是否能減輕細(xì)胞的EMT程度還有待于研究,且FoxO3a通過(guò)怎樣的機(jī)制抑制細(xì)胞EMT過(guò)程還不清楚。希望通過(guò)研究轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a,今后能夠找到于臨床治療慢性腎臟疾病的新手段。
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(收稿日期:2017-03-10) (本文編輯:周亞杰)
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