青光眼由于眼內(nèi)壓力增高導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血，能引起視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞變性。氧化應(yīng)激在神經(jīng)退行性疾病許多病理生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。青光眼氧化應(yīng)激導(dǎo)致蛋白氧化損傷是視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞變性和膠質(zhì)細(xì)胞功能異常的重要因素之一。
活性氧是細(xì)胞代謝過程中存在線粒體電子泄露所產(chǎn)生的副產(chǎn)物，存在一定生理功能，但如果過度增加超過細(xì)胞抗氧化能力，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大分子如DNA、蛋白和脂類分子的氧化損傷。氧化損傷是細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生和抗氧化系統(tǒng)不平衡所造成的后果，超氧陰離子是各種活性氧的源頭，在SOD的催化下能變成過氧化氫。大量研究表明，線粒體功能紊亂會(huì)出現(xiàn)氧化損傷，青光眼也存在這種類型的氧化損傷。
一氧化氮是一種重要信號(hào)分子，也是一種重要活性氧，神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮能激活氨基酸NMDA受體，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死。許多研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮本身也能和超氧陰離子反應(yīng)產(chǎn)生亞硝基陰離子，亞硝基陰離子是一種強(qiáng)毒性自由基，能引起組織細(xì)胞氧化損傷甚至壞死。為研究一氧化氮的毒性，硝普鈉經(jīng)常作為一氧化氮供體被廣泛使用。在神經(jīng)細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，硝普鈉來源的一氧化氮能和超氧陰離子反應(yīng)產(chǎn)生亞硝基陰離子造成體外細(xì)胞損傷。考慮到過去沒有人報(bào)道氫氣對這種損傷的效應(yīng)，本研究擬開展這一研究。
2007年，該日本醫(yī)科大學(xué)小組曾經(jīng)率先報(bào)道氫氣是一種選擇性抗氧化物質(zhì)，能中和羥基自由基和亞硝基陰離子造成的體外神經(jīng)細(xì)胞損傷。隨后大量研究證明氫氣能對各類氧化損傷和炎癥損傷具有保護(hù)效果，給動(dòng)物飲用含氫水可對多種疾病具有治療效果。如0.8mM的氫水滴眼對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷具有治療作用，考慮到氫氣的劑量比較小，難以和細(xì)胞內(nèi)羥基自由基發(fā)生直接中和反應(yīng)，羥基自由基在生物體內(nèi)的生物半衰期只有1納秒，說明許多生物物質(zhì)能與羥基自由基發(fā)生快速反應(yīng)，小劑量氫很難有效競爭中和。更難以想象的是，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)0.04 或0.08 mM的氫水都可以產(chǎn)生一定效應(yīng)。盡管日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)氫能和肝臟糖原結(jié)合，延緩釋放時(shí)間（個(gè)人認(rèn)為這是嚴(yán)重錯(cuò)誤的看法），但仍然無法解釋這一現(xiàn)象。總之，羥基自由基作為氫氣在生物體內(nèi)效應(yīng)分子，其實(shí)并沒有明確，或者氫氣在生物體內(nèi)效應(yīng)分子還沒有真正找到。
動(dòng)物視網(wǎng)膜是一種比較理想的研究工具，最近視網(wǎng)膜整體培養(yǎng)系統(tǒng)已經(jīng)建立，結(jié)合使用動(dòng)物基因工程技術(shù)，能研究許多基因在視網(wǎng)膜上的功能，組織培養(yǎng)技術(shù)能連續(xù)體外培養(yǎng)4天，方便各種藥物學(xué)研究的實(shí)施。目前視網(wǎng)膜培養(yǎng)已經(jīng)在視網(wǎng)膜發(fā)育學(xué)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)退行性疾病研究中發(fā)揮了重要作用。因此，最新研究利用這種工具作為研究氫氣生物學(xué)機(jī)制的手段。
研究采用硝普鈉誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜組織損傷為模型，通過培養(yǎng)基溶解氫氣的方法，采用MitoTMRE檢測試劑盒和TUNEL分別觀察氫氣對硝普鈉誘導(dǎo)導(dǎo)致的視網(wǎng)膜細(xì)胞線粒體膜電位丟失和凋亡。采用免疫組織化學(xué)檢測，評(píng)估視網(wǎng)膜酪氨酸硝化水平和氧化應(yīng)激損傷水平。視網(wǎng)膜損傷程度判斷分別采用視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)、內(nèi)層細(xì)胞核計(jì)數(shù)和視網(wǎng)膜厚度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氫氣能避免視網(wǎng)膜細(xì)胞線粒體膜電位丟失和凋亡，減少氧化和蛋白硝基化損傷，同時(shí)能抑制硝普鈉誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜組織損傷。研究提示氫對視網(wǎng)膜氧化損傷具有保護(hù)作用，可能是通過清除亞硝酸陰離子實(shí)現(xiàn)。氫氣對青光眼等視網(wǎng)膜病變具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
圖1、大鼠視網(wǎng)膜器官組織培養(yǎng)，氫氣對視網(wǎng)膜的線粒體膜電位的影響。
（a）視網(wǎng)膜培養(yǎng)圖。(b)視網(wǎng)膜線粒體膜電位染色病理顯微鏡圖片，從上到下分別是正常的視網(wǎng)膜，用藥物SNAP損傷的視網(wǎng)膜，藥物損傷用氫氣治療的視網(wǎng)膜。（c）膜電位測量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖，藥物損傷導(dǎo)致陽性面積減少，氫氣治療部分恢復(fù)。
圖2、氫氣對視網(wǎng)膜細(xì)胞保護(hù)圖，結(jié)果非常形象，圖中箭頭顯示藥物導(dǎo)致視網(wǎng)膜增多，氫氣治療減少陽性細(xì)胞數(shù)量。
本研究點(diǎn)評(píng)：作者雖然試圖從亞硝酸陰離子角度作為研究切入點(diǎn)，但是只有蛋白硝基化水平這樣一個(gè)間接證據(jù)，可以說目標(biāo)和高大，結(jié)果很暗淡。不過許多研究都是這樣，立論都是高大上，結(jié)果都是平淡無奇，否則論文就發(fā)表在CNS上的不是。為什么會(huì)這樣？立論時(shí)是靠想，但結(jié)果是要靠做出來的。這是日本醫(yī)科大學(xué)太田小組參與的研究，第一第二作者都來自日本醫(yī)科大學(xué)老年病研究所，不過通訊作者卻是來自眼科的另外一個(gè)學(xué)者。
Yokota T, Kamimura N, Igarashi T, et al. Protective effect of molecular hydrogen against oxidative stress caused by peroxynitrite derived from nitric oxide in rat retina[J]. Clinical & Experimental Ophthalmology, 2015, 43(6):568-577.
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