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自CRISPR-Cas系統(tǒng)的機(jī)制被厘清并被改造用于真核細(xì)胞的基因編輯之后，相關(guān)基因編輯工具的開發(fā)、改造和應(yīng)用呈現(xiàn)出爆炸式的增長，這也讓終極夢想—“隨心所欲”的精準(zhǔn)基因編輯—不再遙不可及。目前而言，CRISPR-Cas相關(guān)的工具在基因編輯、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳學(xué)修飾、RNA編輯（詳見BioArt報(bào)道：『珍藏版』綜述 | RNA靶向的CRISPR系統(tǒng)——從宏基因組到RNA調(diào)控）和核酸檢測等多個(gè)研究領(lǐng)域均有重要應(yīng)用。近年來以改變基因組DNA序列為目標(biāo)的基因編輯工具的開發(fā)更是突飛猛進(jìn)：除最基本的Cas核酸酶外，單堿基編輯器（base editors）、Cas轉(zhuǎn)座及重組酶系統(tǒng)和引導(dǎo)編輯器（prime editors）的出現(xiàn)讓基因編輯有了更多選擇。不同的基因編輯工具各有其適用場景，此外，研究者也正針對各類工具在編輯活性、編輯范圍和編輯特異性中的不足之處加以改進(jìn)，這讓CRISPR-Cas相關(guān)的基因編輯工具更加多樣化，卻也讓工具的合理選擇和針對性優(yōu)化更具挑戰(zhàn)性。

2020年6月22日，來自美國哈佛大學(xué)與麻省理工學(xué)院Broad研究所的David R. Liu實(shí)驗(yàn)室在Nature Biotechnology發(fā)表題為Genome editing with CRISPR–Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors的綜述。文章重點(diǎn)關(guān)注CRISPR-Cas相關(guān)的基因編輯工具，分別對Cas核酸酶、單堿基編輯器、Cas轉(zhuǎn)座及重組系統(tǒng)和引導(dǎo)編輯器（圖1）的編輯特性、應(yīng)用場景及近來的發(fā)展態(tài)勢進(jìn)行了總結(jié)，希望此文能為CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用和研究人員在工具的合理選擇和針對性優(yōu)化過程中提供指導(dǎo)。

圖1 本文所關(guān)注的基因編輯系統(tǒng)

CRISPR-Cas核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯

CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，因其向?qū)NA的可編程特性和Cas核酸酶在多種細(xì)胞和組織中的明顯活性而被廣泛用于基因編輯研究。本小節(jié)著眼于自然界中發(fā)現(xiàn)的多種Cas核酸酶，對其在基因編輯中的多種應(yīng)用方式進(jìn)行總結(jié)，并對以拓展編輯范圍和增加酶切特異性為目標(biāo)的各種Cas突變體的開發(fā)加以匯總。

目前的研究表明，自然界中的CRISPR-Cas系統(tǒng)可分為兩大類：1型借助于多蛋白復(fù)合物實(shí)現(xiàn)核酸的切割；2型則依賴于單一的蛋白核酸酶實(shí)現(xiàn)切割。考慮到單一核酸酶的應(yīng)用優(yōu)勢，2型CRISPR系統(tǒng)被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究。此外，根據(jù)Cas核酸酶的不同，類型2可細(xì)分為II、V和VI三種亞類，其中大多數(shù)II型Cas9和V型Cas12 具有RNA介導(dǎo)的DNA內(nèi)切酶活性；而VI型Cas13蛋白則具有靶向和切割RNA的能力。此處將著眼于能實(shí)現(xiàn)DNA編輯的Cas9和Cas12核酸酶。

Cas9核酸酶 自然界中，Cas9需要依賴于兩條短鏈的 crRNAs（CRISPR來源的RNAs）和 tracrRNA（反式作用的crRNA）方能形成功能性的核糖核蛋白復(fù)合物發(fā)揮切割雙鏈DNA的功能。而后研究者將crRNA與tracrRNA融合獲得單鏈向?qū)NAs（sgRNAs），sgRNA可引導(dǎo)Cas9定位至含特定PAM序列的靶位點(diǎn)DNA處，隨后開啟雙鏈DNA的解旋并誘導(dǎo)RNA-DNA雜合鏈的形成。此過程中，非互補(bǔ)的DNA鏈被向?qū)NA替換，最終形成單鏈DNA的“R-loop”結(jié)構(gòu)。Cas9切割雙鏈DNA時(shí)，主要在PAM位點(diǎn)上游3bp處引入平末端的DSBs。

R-loop的形成會(huì)改變Cas9構(gòu)象而激活其核酸酶功能域，最終誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂（DSBs）。Cas9對DNA雙鏈的切割分別依賴于HNH和類RuvC兩大功能域。失活單一的核酸酶功能域可獲得Cas9單切口酶；而同時(shí)失活兩種核酸酶功能域則可獲得仍保留結(jié)合DNA能力的失活型Cas9（dCas9）。

目前用于真核生物基因編輯的Cas9同源蛋白眾多，它們在大小、PAM特性、向?qū)NA結(jié)構(gòu)、間隔序列長度、編輯效率和編輯特異性上各有特點(diǎn)。這讓研究者在應(yīng)用中有了更多選擇。

Cas12核酸酶 與Cas9不同，Cas12核酸酶只有單一的類RuvC核酸酶功能域發(fā)揮誘導(dǎo)DSBs的功能。Cas12核酸酶依賴于單一的crRNA引導(dǎo)實(shí)現(xiàn)DNA定位，并在原間隔序列的遠(yuǎn)PAM端切割并產(chǎn)生粘性末端，這與Cas9通常在近PAM端切割產(chǎn)生平末端的特性恰好相反。

Cas12a（早期被命名為Cpf1）是最早被發(fā)現(xiàn)并廣泛用于基因組編輯的Cas12核酸酶，它可以通過自身的RNA酶功能域?qū)Π鄠€(gè)crRNA的表達(dá)陣列進(jìn)行剪切，從而實(shí)現(xiàn)多基因同時(shí)編輯。此外，多種Cas12同源蛋白在完成對目標(biāo)位點(diǎn)的識別并激活內(nèi)在的核酸酶活性之后，會(huì)無差別的切割單鏈DNA和RNA，這一特性可被用于核酸檢測（詳見BioArt報(bào)道：一個(gè)悲喜參半的故事丨植生所王金博士等報(bào)道Cas12a對于靶標(biāo)ssDNA和非靶標(biāo)ssDNA的切割特性研究）。

修復(fù)通路 細(xì)胞內(nèi)存在多種DSBs的修復(fù)機(jī)制，細(xì)胞類型、細(xì)胞狀態(tài)以及DSBs的特性均會(huì)影響修復(fù)機(jī)制的選擇?？傮w而言，DSBs修復(fù)機(jī)制可分兩大類：一是斷裂的DNA雙鏈末端連接，此過程中通常會(huì)隨機(jī)引入插入缺失突變；另一類則是DNA模板介導(dǎo)的同源重組修復(fù)（HDR）。在絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，末端連接途徑占據(jù)主流，而HDR則通常只在分裂的細(xì)胞中發(fā)揮修復(fù)作用，且依賴于多種主要在細(xì)胞S期和G2期表達(dá)的蛋白。

總體而言，CRISPR-Cas核酸酶誘導(dǎo)的DSBs主要由末端連接介導(dǎo)的易錯(cuò)通路加以修復(fù)。為增強(qiáng)HDR介導(dǎo)的修復(fù)效率，研究者嘗試過多種策略，一種策略是使用Cas9單切口酶抑制DSBs的形成并增強(qiáng)HDR修復(fù)效率；此外，HDR修復(fù)效率還可通過基因沉默、小分子抑制劑或蛋白過表達(dá)等方式抑制非同源末端連接修復(fù)或增強(qiáng)HDR通路活性等策略加以提高。不過，考慮到DNA修復(fù)蛋白的重要性，這類策略通常難以用于在體研究。為改善HDR修復(fù)的效率，研究者還嘗試多種其它策略，或?qū)NA模板加以優(yōu)化，或促進(jìn)模板DNA在DSBs位點(diǎn)的富集，或增強(qiáng)細(xì)胞周期的同步化，或使用AAV病毒基因組做模板。雖然這類策略可不同程度的改善HDR修復(fù)效率，絕大多數(shù)情況下，細(xì)胞內(nèi)DSBs修復(fù)的主要途徑依然是非同源末端連接介導(dǎo)的易錯(cuò)修復(fù)，這在非分裂細(xì)胞中尤為明顯。

值得注意的是，除了激活DNA修復(fù)通路，細(xì)胞內(nèi)DSBs的產(chǎn)生還可能引發(fā)不可預(yù)知的安全風(fēng)險(xiǎn)：導(dǎo)致非必要的基因組改變?nèi)缛旧w易位和大片段缺失，p53通路的活化等等（詳見BioArt報(bào)道：NBT丨CRISPR編輯技術(shù)面臨新的安全隱患——胡家志點(diǎn)評；特別關(guān)注丨 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的新風(fēng)險(xiǎn)——破壞DNA-PK依賴的修復(fù)通路引發(fā)DNA損傷；Nat Genetics | Cas9蛋白本身可激活p53通路并促進(jìn)p53失活型突變的擇性富集），這種潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)提示我們，CRISPR-Cas系統(tǒng)仍有諸多有待優(yōu)化之處。

拓展編輯范圍為目的的Cas9突變體的開發(fā) 在CRISPR-Cas技術(shù)的研發(fā)過程中，拓展其編輯范圍是研究的主要方向之一。Cas蛋白要實(shí)現(xiàn)DNA定位，主要依賴于PAM序列。目前發(fā)現(xiàn)的多種Cas9及Cas12同源蛋白對PAM序列的要求各不相同，這種多樣性也被研究者充分利用，以拓展基因組的可編輯范圍。不過目前PAM序列依然嚴(yán)重限制了CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用，使得基因組的很大一部分難以被編輯。為此，眾多研究者努力的改造優(yōu)化Cas9和Cas12蛋白，以求最大程度的解除PAM對其應(yīng)用的限制（詳見BioArt報(bào)道：特別推薦丨基因魔剪CRISPR/Cas9新進(jìn)展——新型利器xCas9 3.7利刃出鞘；NBT | 升級版ScCas9——高活性、高特異性與更好的PAM兼容性；Science | 擺脫P(yáng)AM困擾—Cas9強(qiáng)勢升級獲得基因編輯新利器SpRY）。

目前，自然界來源的Cas同源蛋白及其各種突變體可識別的PAM特征序列已經(jīng)過半，這標(biāo)志著該領(lǐng)域已取得長足進(jìn)步。不過，進(jìn)一步改善Cas蛋白的編輯范圍依然任務(wù)艱巨，這其中尤以非嘌呤PAM序列的識別最具挑戰(zhàn)性。目前的研究多集中于SpCas9編輯范圍的拓展，不過Cas12同源蛋白及突變體的研究依然值得重視。此外，研究者還注意到，Cas突變體的活性普遍不如其野生型蛋白，這在人類疾病動(dòng)物模型的研究及部分內(nèi)源蛋白結(jié)合的DNA位點(diǎn)處尤為顯著。因此，構(gòu)建更具活性的Cas突變體并進(jìn)一步拓展其PAM特征序列將是未來研究的重要方向。

改善編輯特異性為目的的Cas9突變體的開發(fā) Cas核酸酶介導(dǎo)的精準(zhǔn)編輯依賴于其區(qū)分靶位點(diǎn)和高相似度非靶位點(diǎn)的能力。雖然部分Cas9及Cas12同源蛋白本身具有較高特異性，當(dāng)下研究的熱點(diǎn)之一依然是開發(fā)Cas突變體以增強(qiáng)其區(qū)分靶位點(diǎn)序列和高相似度非靶位點(diǎn)的能力，從而提高Cas系統(tǒng)的編輯特異性。當(dāng)下可檢測Cas核酸酶脫靶活性的高靈敏度方法的開發(fā)極大的推動(dòng)了高特異性Cas突變體的研究。

改善編輯特異性的思路之一是借助于結(jié)合于臨近位點(diǎn)的兩個(gè)Cas9以誘導(dǎo)單一的DSB。此外研究者通過構(gòu)建Cas9的突變體為改善Cas9蛋白本身的編輯特異性。除針對Cas蛋白進(jìn)行突變外，研究發(fā)現(xiàn)對sgRNAs進(jìn)行優(yōu)化有助于脫靶活性的降低（詳見BioArt報(bào)道：Nat Biotech丨提高CRISPR特異性的新方法）。

盡管高特異性Cas突變體的研究取得了長足進(jìn)步，研究者注意到，這類突變體的靶位點(diǎn)編輯活性常不盡如人意。此外，大多數(shù)高特異性Cas9突變體對向?qū)NA有更高要求，向?qū)NA的些許改變很可能導(dǎo)致其活性的喪失。這一系列不足之處極大的限制了高特異性Cas9突變體的應(yīng)用，因此對CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，在降低脫靶活性的同時(shí)保持其有效的靶位點(diǎn)編輯活性，并保障系統(tǒng)與各類向?qū)NA變體的兼容性，是未來研究的重要方向。

單堿基編輯器介導(dǎo)的基因組編輯

單堿基編輯器無需誘導(dǎo)DSBs和補(bǔ)充DNA模板的條件下便可實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)的精準(zhǔn)點(diǎn)突變，且該過程不依賴于HDR修復(fù)途徑。目前可用的單堿基編輯器是將活性受損的CRISPR-Cas核酸酶（無誘導(dǎo)DSBs的能力）與單鏈DNA脫氨基酶融合而得，特定條件下，還需融合可調(diào)控DNA修復(fù)機(jī)制的蛋白?，F(xiàn)有的單堿基編輯器有兩大類：一類是融合胞苷脫氨基酶的胞嘧啶堿基編輯器（CBEs），可催化C·G--T·A堿基對的轉(zhuǎn)換；另一類則是融合優(yōu)化過TadA*脫氧腺苷脫氨基酶的腺嘌呤堿基編輯器（ABEs），可實(shí)現(xiàn)A·T--G·C堿基對的轉(zhuǎn)換。CBEs和ABEs可有效介導(dǎo)四種堿基轉(zhuǎn)換突變（C-T，A-G，T-C和G-A），這類突變約占目前人類致病變異的30%。目前單堿基編輯器被廣泛用于多種細(xì)胞系和模式生物中，并用于多種人類遺傳病動(dòng)物模型的構(gòu)建和治療（詳見BioArt報(bào)道：異軍突起：單堿基基因編輯技術(shù)）。

單堿基編輯過程中目標(biāo)核苷酸的單堿基編輯依賴于脫氨基酶與底物核苷酸的結(jié)合，其中可被有效編輯的核苷酸位置被定義為單堿基編輯的“活性窗口”。對于以SpCas9為基礎(chǔ)的經(jīng)典CBEs和ABEs，其活性窗口主要位于前間隔序列的第4-8位（前間隔序列的起始核苷酸定義為1位，PAM定義為21-23位），當(dāng)然，活性窗口并非完全固定，還會(huì)受到DNA狀態(tài)如染色體結(jié)構(gòu)的影響。

活性窗口中底物核苷酸的脫氨基化會(huì)導(dǎo)致尿嘧啶和次黃嘌呤的形成，為改善單堿基編輯的效率， CBEs系統(tǒng)中通常會(huì)進(jìn)一步融合尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGIs）蛋白以抑制細(xì)胞對基因組中尿嘧啶堿基的修復(fù)。此外，多數(shù)單堿基編輯器均采用Cas單切口酶以切斷未編輯的DNA鏈，從而促進(jìn)以發(fā)生編輯的DNA鏈為模板的修復(fù)，最終促進(jìn)靶位點(diǎn)堿基對的穩(wěn)定編輯。研究者還發(fā)現(xiàn)，對融合蛋白間的接頭序列加以優(yōu)化，或增加UGI功能域的數(shù)目可進(jìn)一步提高CBEs的編輯效率。而通過核定位序列的增加和密碼子優(yōu)化可進(jìn)一步提高編輯效率。除此之外，研究者還針對單堿基編輯器的編輯范圍、編輯效率及產(chǎn)物的純度做了更多優(yōu)化。

單堿基編輯器編輯范圍的拓展 單堿基編輯器借助于Cas蛋白實(shí)現(xiàn)DNA定位，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)處特定活性窗口內(nèi)目標(biāo)核苷酸的精準(zhǔn)編輯。因此，PAM序列對單堿基編輯器的編輯范圍有重要影響。為此早期研究者致力于使用可識別不同PAM的Cas同源蛋白和突變體以拓展單堿基編輯器的編輯范圍。

此外，通過將脫氨基酶與不同的Cas同源蛋白融合，研究者可獲得小型化的單堿基編輯器以用于AAV病毒的包裝和遞送。此外，研究者還利用內(nèi)含肽對單堿基編輯系統(tǒng)加以拆分，從而可通過雙AAV系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)高效的在體單堿基編輯。

考慮到各類基因編輯工具的靶位點(diǎn)編輯效率因位點(diǎn)、細(xì)胞類型和細(xì)胞狀態(tài)而異，開發(fā)更為多樣化的單堿基編輯工具對單堿基編輯的未來應(yīng)用有重要意義。

R-loop與脫氨基酶相互作用的調(diào)整 R-loop和單鏈DNA的形成是單堿基編輯器發(fā)揮功能的關(guān)鍵。脫氨基酶與R-loop的相互作用對單堿基編輯器的效率有決定性影響。通?；钚源翱谖挥赗-loop中最易接近的核苷酸位點(diǎn)。研究者發(fā)現(xiàn)，更換不同類型的Cas蛋白或脫氨基酶對活性窗口也有重要影響。這或許是因?yàn)镃as蛋白和脫氨基酶的改變會(huì)對R-loop與脫氨基酶的相互作用產(chǎn)生重要影響。

當(dāng)下關(guān)于Cas同源蛋白及其突變體的研究進(jìn)展迅速，適用于單堿基編輯的脫氨基酶及其突變體的篩選也取得重要成果，它們之間的不同組合極大的豐富了單堿基編輯的工具箱，也讓R-loop與脫氨基酶之間的相互作用有了更多變化，由此獲得的單堿基編輯器也擁有了更為多樣化的活性窗口，這讓單堿基編輯器更具應(yīng)用潛力。

單堿基編輯脫靶風(fēng)險(xiǎn)的改善 單堿基編輯的脫靶效應(yīng)較為復(fù)雜，除非靶位點(diǎn)的突變外，還包括靶位點(diǎn)處目標(biāo)堿基的顛換（C·G—[A·T或G·C]; A·T—[T·A或C·G]），靶位點(diǎn)處非目標(biāo)堿基的突變及靶位點(diǎn)處的插入缺失突變。

堿基顛換突變常見于CBEs中，源自DNA糖基化酶切除DNA中尿嘧啶產(chǎn)生的無堿基位點(diǎn)的易錯(cuò)修復(fù)。研究者發(fā)現(xiàn)，增加UGI的拷貝數(shù)或促進(jìn)其表達(dá)有助于降低堿基顛換的發(fā)生頻率。

靶位點(diǎn)處非目標(biāo)堿基的突變與單堿基編輯器的活性窗口關(guān)系密切?；钚源翱谶^寬易引入非目標(biāo)堿基的突變，研究者已開發(fā)出多種活性窗口更窄的CBEs以降低非目標(biāo)堿基的突變風(fēng)險(xiǎn)，但針對ABEs的相關(guān)研究目前較為匱乏。

目前應(yīng)用較為廣泛的單堿基編輯器多依賴于Cas單切口酶，這極大的降低了靶位點(diǎn)插入缺失突變發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。不過脫氨基化的堿基在修復(fù)過程中易導(dǎo)致編輯鏈的斷裂，而Cas單切口酶則多作用于非編輯鏈，因此單堿基編輯過程中依然存在DNA雙鏈斷裂的可能。為進(jìn)一步降低靶位點(diǎn)處插入缺失突變發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，研究者嘗試在CBEs系統(tǒng)中融合Mu Gam蛋白以保護(hù)DSBs末端。此外，將單切口酶替換為失活型Cas同樣能有效降低插入缺失突變的風(fēng)險(xiǎn)，不過也會(huì)降低靶位點(diǎn)的編輯效率。

除靶位點(diǎn)的脫靶風(fēng)險(xiǎn)外，單堿基編輯器在DNA和RNA的非靶位點(diǎn)處同樣存在脫靶效應(yīng)。其中DNA水平的脫靶效應(yīng)可分為Cas依賴型和Cas非依賴型脫靶。Cas依賴型脫靶在ABEs和CBEs均有發(fā)生，可通過使用高特異性的Cas蛋白及突變體、截短型sgRNA和RNP復(fù)合物遞送而優(yōu)化，此外，通過蛋白質(zhì)工程對脫氨基酶進(jìn)行改造也可以優(yōu)化Cas依賴型的脫靶效應(yīng)。Cas非依賴型脫靶源自脫氨基酶與細(xì)胞內(nèi)基因組中瞬時(shí)存在的單鏈DNA的相互作用，主要發(fā)生在CBEs系統(tǒng)中。目前研究者主要通過構(gòu)建脫氨基酶突變體和不同類型的脫氨基酶篩選對此加以優(yōu)化。

由于CBEs和ABEs系統(tǒng)中的脫氨基酶多可作用于RNA的堿基發(fā)揮脫氨基作用，早期開發(fā)的單堿基編輯器多在RNA水平存在明顯的脫靶效應(yīng)。目前研究者多通過蛋白質(zhì)工程構(gòu)建脫氨基酶的突變體以降低其在RNA水平的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。

選用單堿基編輯器的注意事項(xiàng) 現(xiàn)有的單堿基編輯器種類繁多且各具特色。單堿基編輯器種類的多樣化讓研究者有更多選擇空間，卻也讓單堿基編輯器的合理選擇更具挑戰(zhàn)性。總體而言，選用單堿基編輯器時(shí)須考慮多種因素，包括靶位點(diǎn)附近PAM的可用性，位點(diǎn)的堿基序列特征，活性窗口，編輯后產(chǎn)物的單一性和DNA特異性，只有將各關(guān)鍵因素綜合考量方能選到合適的單堿基編輯器。當(dāng)然近年來人工智能和機(jī)器學(xué)習(xí)的飛速發(fā)展也讓基因編輯模型的構(gòu)建有了諸多進(jìn)展，這對工具的合理選擇有重要指導(dǎo)意義。

單堿基編輯器介導(dǎo)的靶位點(diǎn)隨機(jī)突變 除精準(zhǔn)編輯之外，在特定條件下，單堿基編輯器還適用于靶位點(diǎn)的隨機(jī)突變。策略之一是使用無UGI融合的CBEs系統(tǒng)；另一種策略則是將胞苷脫氨基酶與腺嘌呤脫氨基酶同時(shí)融合于單一的Cas蛋白，由此獲得的單堿基編輯器可同時(shí)誘導(dǎo)C-T和A-G突變（詳見BioArt報(bào)道：專家點(diǎn)評4篇NBT | “”雙劍合璧——李大力組開發(fā)新型雙堿基基因編輯器）。此外，多種胞苷脫氨基酶的串聯(lián)融合，或是借助于MS2和Suntag系統(tǒng)構(gòu)建的多組分單堿基編輯器亦可實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)的隨機(jī)突變。有研究者還嘗試將易錯(cuò)DNA多聚酶與Cas9單切口酶融合，獲得的堿基編輯工具EvolvR在大腸桿菌中可成功實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)隨機(jī)突變，且編輯窗口可達(dá)350bp。

單堿基編輯器的未來展望 在諸多研究者的努力下，單堿基編輯研究進(jìn)展迅速且極具臨床應(yīng)用潛力。目前而言，單堿基編輯器在編輯效率、編輯特異性和在體遞送等方面仍有待進(jìn)一步優(yōu)化。此外，開發(fā)活性可控的單堿基編輯器亦將拓展其在基礎(chǔ)研究和臨床治療中的應(yīng)用前景。

考慮到單堿基編輯的獨(dú)特機(jī)制，以及現(xiàn)有單堿基編輯器CBEs和ABEs在多種分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞和在體模型中的優(yōu)良特性，開發(fā)可實(shí)現(xiàn)堿基顛換的單堿基編輯工具依然讓人期待，這對基因編輯的未來發(fā)展有非常重要的意義。

轉(zhuǎn)座酶和重組酶介導(dǎo)的基因編輯

活細(xì)胞基因組中的定向整合一直極具挑戰(zhàn)性。雖然核酸酶和單切口酶介導(dǎo)的HDR可實(shí)現(xiàn)基因組中的定向整合，但僅局限于可分裂的細(xì)胞。近年來研究者發(fā)現(xiàn)自然界中存在CRISPR轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)細(xì)菌基因組中的定向整合；研究者還將Cas蛋白與轉(zhuǎn)座酶融合，同樣可實(shí)現(xiàn)細(xì)菌基因組中的定向整合。此外，研究者還將Cas蛋白與重組酶融合，可在人源細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA片段的刪除。

CRISPR轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng) 對CRISPR系統(tǒng)多樣性的探索讓研究者發(fā)現(xiàn)了可在細(xì)菌中適用的CRISPR轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)（詳見BioArt報(bào)道：專家點(diǎn)評Science Nature長文| 當(dāng)CRISPR遇上轉(zhuǎn)座子——實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性DNA片段的高效、特異插入）。

dCas-轉(zhuǎn)座酶及重組酶融合系統(tǒng) 將轉(zhuǎn)座酶或重組酶與dCas9融合或有助于定向轉(zhuǎn)座和重組。目前而言，dCas-轉(zhuǎn)座酶融合系統(tǒng)可在大腸桿菌中發(fā)揮一定效果；而dCas-重組酶融合系統(tǒng)則能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA片段的刪除，當(dāng)然，其編輯效率不盡如人意，且適用范圍相當(dāng)有限。

CRISPR轉(zhuǎn)座酶及重組酶系統(tǒng)的未來發(fā)展 CRISPR轉(zhuǎn)座酶及重組酶系統(tǒng)依然處于起步階段，雖然CRISPR轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)在體外和細(xì)菌系統(tǒng)中的效果令人欣喜，但其仍難以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮功能。因此，深入探究CRISPR轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)的作用機(jī)制并開發(fā)真核細(xì)胞可用的定向轉(zhuǎn)座系統(tǒng)將是基因編輯領(lǐng)域的重大突破。

引導(dǎo)編輯（Prime editing）

基因編輯的很多應(yīng)用場景，特別是哺乳動(dòng)物基因組中致病突變的誘導(dǎo)和修復(fù)，依賴于包括點(diǎn)突變、小片段插入和缺失突變在內(nèi)的精準(zhǔn)基因編輯。如上文所述，CRISPR-Cas核酸酶可誘導(dǎo)DSBs，在末端連接修復(fù)途徑下可實(shí)現(xiàn)DNA序列的刪減和破壞；而在HDR途徑下則可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)修復(fù)，不過常伴有嚴(yán)重的插入缺失脫靶突變。單堿基編輯可在不誘導(dǎo)DSBs的條件下實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的單堿基編輯，但只能誘導(dǎo)堿基轉(zhuǎn)換而無法實(shí)現(xiàn)堿基顛換。當(dāng)然，單堿基編輯也無法實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的插入缺失編輯。此外，單堿基編輯器常會(huì)導(dǎo)致靶位點(diǎn)非目標(biāo)堿基的脫靶突變，且部分位點(diǎn)由于缺乏合適的PAM序列而難以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)堿基的精準(zhǔn)編輯。

2019年出現(xiàn)的引導(dǎo)編輯有著廣譜的編輯能力，理論上可精準(zhǔn)誘導(dǎo)所有類型的單堿基突變、小片段插入和缺失突變（詳見BioArt報(bào)道：專家點(diǎn)評Nature | David Liu再出重磅基因編輯新工具，可實(shí)現(xiàn)堿基隨意轉(zhuǎn)換與增刪）。

雖然引導(dǎo)編輯的效果令人驚喜，但依然有諸多關(guān)鍵問題有待解決。這包括細(xì)胞狀態(tài)及細(xì)胞類型對引導(dǎo)編輯效率的影響；引導(dǎo)編輯過程中涉及的DNA修復(fù)機(jī)制以及如何實(shí)現(xiàn)引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的在體應(yīng)用。此外，現(xiàn)有的引導(dǎo)編輯系統(tǒng)中逆轉(zhuǎn)錄酶體積過大，這并不利于系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用。因此，探尋適用于引導(dǎo)編輯的小型逆轉(zhuǎn)錄酶對其未來應(yīng)用相當(dāng)關(guān)鍵。

總結(jié)而言，本綜述對以改變基因組DNA序列為目標(biāo)的CRISPR-Cas相關(guān)的基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行了系統(tǒng)且詳實(shí)的總結(jié)，這可讓我們對CRISPR-Cas相關(guān)的基因編輯系統(tǒng)有較全面的認(rèn)識，也為基因編輯工具的合理選用提供了重要指導(dǎo)。此外，本綜述對領(lǐng)域面臨的困難與挑戰(zhàn)進(jìn)行了分析，并對基因編輯研究的未來方向給出了很有深度的見解。

原文鏈接

https://doi.org/10.1038/s41587-020-0561-9

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