在正典生物特約蓄牧思維云課堂“家禽替抗藥物篩選技術(shù)與替抗方案”系列講座上,華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)寄生蟲教研室主任林瑞慶老師帶來《產(chǎn)氣莢膜梭菌及其檢測技術(shù)》,以下是文字內(nèi)容:
雞壞死性腸炎——飼料禁抗后養(yǎng)禽業(yè)最大的挑戰(zhàn)
產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的雞壞死性腸炎(NE)是養(yǎng)雞業(yè)危害最大的疾病之一,造成巨大損失;常發(fā)于2~6周肉雞,11周齡前肉雞以及3-6月蛋雞也多有報道。
急性型突然大量死亡,空腸、回腸粘膜大量彌漫性壞死灶,蔓延至十二指腸、盲腸,死亡率常在2%~10%之間;亞臨床型不表現(xiàn)明顯臨床癥,但腸粘膜損傷,采食量降低、生長受阻,有時還伴有肝炎和膽管肝類。
據(jù)美國家禽病理學(xué)會(USAHA)的年度報告,球蟲病是近30年來發(fā)生率和經(jīng)濟損失位居前五的主要疾病,2017-2019年均位列第一。壞死性腸炎則緊隨其后位居第二。作為一種“復(fù)燃的疾病”,雞NE被視為飼料禁抗后養(yǎng)禽業(yè)最大的挑戰(zhàn)。
產(chǎn)氣莢膜梭菌的特點與流行病學(xué)
1、病原形態(tài)
產(chǎn)氣莢膜梭菌是一類革蘭氏染色陽性、可形成莢膜、產(chǎn)芽孢的艷陽性人獸共患致病桿菌。
2、病原特點
(1)在自然環(huán)境中分布極廣,是人畜腸道的一種常在菌。
(2)機會致病病原,在一定條件下,可引雞急性或亞臨床型NE。
(3)厭氧菌,但對厭氧程度要求不嚴格,對營養(yǎng)要求不苛刻。
(4)形成芽孢,能抵抗不良環(huán)境,在傳播中起重要作用。
(5)腸道細胞、膽酸類以及各種營養(yǎng)成分有助于芽孢萌發(fā)。
(6)快速增殖,約8~12min—代。
(7)產(chǎn)生致病因子已鑒定有二十多種外毒素和水解酶,根據(jù)6種主要毒素目前可分為7種型(A-G),雞主要為A、C、F和G。
3、流行病學(xué)
(1)各品種禽類均可感染,一年四季均可發(fā)生,尤以潮濕溫暖的季節(jié)發(fā)病較多。
(2)多發(fā)于2~6W:母源抗體 內(nèi)外環(huán)境因素。
(3)芽孢在惡劣環(huán)境條件的影響下具有很強的存活力,可存活數(shù)年。
(4)健康家禽分離到的產(chǎn)氣莢膜梭菌通常不致病。
(5)臨床分離株的耐藥性問題突出:氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可胺類等耐藥性廣泛存在。
(6)各種誘因(球蟲病等)引起腸道內(nèi)環(huán)境變化,產(chǎn)氣莢膜梭菌增殖引致NE。
國外關(guān)于商品雞NE大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查報告顯示發(fā)率5.3%-12.3%,高峰期至35%,由于缺乏方便、可靠的調(diào)查方法,大規(guī)模調(diào)查數(shù)據(jù)有限。國內(nèi)雞NE沒有系統(tǒng)的調(diào)查,但近年有大量的病例報道,表明該病流行極廣,危害較大,日益引起關(guān)注。
4、癥狀及病變
急性型病雞表現(xiàn)精神萎頓、嗜睡、羽毛蓬亂、食欲減退,有的嚴重腹瀉,有些排帶血糞便。病程持續(xù)時間短,通常經(jīng)過1~2天死亡,病死率每天為0.3%~0.5%。
亞臨床型雞腸道黏膜發(fā)生慢性損傷,雞群采食量降低、體重下降、料重比升高,種雞的整齊度較差,有時還伴有肝炎和膽管肝炎。
病變情況
亞臨床型NE常出現(xiàn)非出血性潰瘍,多點深層潰瘍,形成假膜還有膽管肝炎。急性型NE的表現(xiàn)就更嚴重一些:內(nèi)容物水分多,炎性滲出;粘膜充血、出血、潰瘍;彌漫性出血斑;腸腔內(nèi)多量氣泡;比腸道充脹氣體,腸壁薄脆;上腸腔充血等。
雞腸道病原的鑒別診斷
從糞便鑒別來看,球蟲病糞便為拉稀或帶血;而壞死性腸炎的糞便有比較多的顏料色,還帶有粘液、腸粘膜脫離物和未消化的飼料等混雜成分。
臨床上如果只是對糞便鑒別還是比較難區(qū)分的,為此,需要進行解剖,進行腸道病變鑒別診斷。主要鑒別小腸中后段的病變,球蟲病變可能會出現(xiàn)出血點(巨型艾美耳球蟲)或黑白斑點(毒害艾美耳球蟲);而產(chǎn)氣莢膜梭菌病變會導(dǎo)致腸道彈性變差、腸壁變薄、出血斑點,腸腔脹氣、充滿液體,腸黏膜充血、壞死,附著纖維素和細胞碎片等。
最終需要通過腸道刮片等進行病原學(xué)診斷來進行確診。
產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測技術(shù)
1、樣品采集
采集壞死性腸炎病雞或疑似病雞的腸道或糞便,優(yōu)先選擇腸道,糞便放置時間長就不容易分離。需要注意不要采集已經(jīng)病死的雞的樣品,因為病死后容易被外界產(chǎn)氣莢膜梭菌污染,并且常在菌可能增殖,失去了檢測的意義;還需避免采樣時的交叉污染。
2、檢測方法
方法一:染色鏡檢
刮取腸道病變部位粘膜,革蘭氏染色后鏡檢,。但最好先進行細菌分離后鏡檢鑒定。需要注意掌握脫色程度,如脫色過度,陽性菌可被誤染為陰性菌;菌齡影響染色結(jié)果,培養(yǎng)時間過長,或已死亡及部分菌體自行溶解,常呈陰性反應(yīng)。以均勻分散開的細菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準,過于密集的細菌,常常呈現(xiàn)假陽性。
方法二:細菌分離
腸道內(nèi)容物、糞便或內(nèi)臟組織先經(jīng)液體培養(yǎng)基(如液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基等)增菌。
增菌后再分離,可用多種鑒別固體培養(yǎng)基培養(yǎng)分離鑒定。
TSC卵黃平板的選擇性抗生素(多粘菌素或環(huán)絲氨酸)可對某些厭氧菌或兼性厭氧菌有抑制作用而具有一定的選擇性;培養(yǎng)基含鐵和亞硫酸鹽,形成一種黑色的硫化鐵沉淀即黑色菌落;TSC平板還含卵黃,產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的卵磷脂酶水解卵黃卵磷脂,使黑色菌落的周圍形成一個不透明的暈(Nagler反應(yīng))。
除了注意操作上的規(guī)范,在TSC卵黃平板的基礎(chǔ)上,覆蓋一層無卵黃TSC,將顯著提高分離率。
純化和保菌:取單菌落接種FT液體培養(yǎng)基,將管內(nèi)的培養(yǎng)物混勻用接種環(huán)蛇形劃線于TSC的平板上,40℃厭氧培養(yǎng)16-24h。黑色單菌培養(yǎng)后進一步鑒定,后加20%的甘油,標(biāo)記信息,用封口膜封好,放入-20℃或-80℃冰箱保存。
方法三:生化鑒定
根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌的生化特性進行分析,對牛乳培養(yǎng)基的'暴烈發(fā)酵“是最突出的生化特性,發(fā)酵乳糖使其酸凝,產(chǎn)生的大量氣體又使其破裂成多孔海綿狀。
方法四:分子鑒定
通過PCR擴增16S rDNA測序分析。
技術(shù)路線圖
可通過多重PCR擴增產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要毒素基因進行鑒定和分型。
在林瑞慶老師的分享結(jié)束后,有許多網(wǎng)友提出了自己關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭菌這方面的疑惑,林老師在蓄牧思維云學(xué)院線上回復(fù)了網(wǎng)友的問題,下面是互動問答匯集:
網(wǎng)友
林老師,怎樣降低有機肉雞壞死性腸炎發(fā)生率?
林瑞慶
有機雞因為不能使用化學(xué)藥物、抗生素等方法控制傳染性疾病,所以需從生物防控和管理環(huán)節(jié)等減少疫病的發(fā)生。
先從壞死性腸炎發(fā)生的原因來去考慮,壞死性腸炎由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起,而該菌是一種機會性致病菌,所以它的發(fā)生有一定的誘因。從產(chǎn)氣莢膜梭菌引起壞死性腸炎的因素來看,維持腸道穩(wěn)態(tài)是關(guān)鍵。需要有清潔的水源和優(yōu)質(zhì)飼料;此外,高飼養(yǎng)密度還有應(yīng)激等問題都會導(dǎo)致雞的生理狀況變化,引起腸道紊亂;還有如球蟲等腸道疾病和病毒病等破壞腸道粘膜完整性,誘發(fā)壞死性腸炎,需要進行相應(yīng)的預(yù)防和控制??傊?,需要從各個方面維護好雞的腸道,減少壞死性腸炎的發(fā)生,降低環(huán)境中的產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量。還可進行定期或不定期監(jiān)測,及時處理感染的病雞,減少環(huán)境中產(chǎn)氣莢膜梭菌的存在。
網(wǎng)友
林老師,我用球蟲疫苗結(jié)合產(chǎn)氣莢膜桿菌攻毒,只有腸壁變薄的現(xiàn)象,是嚴重還是不嚴重?
林瑞慶
可能這位網(wǎng)友想做動物模型,一般國內(nèi)的疫苗基本是弱毒苗,致病性比較弱,對腸道的損傷比較少,不易誘發(fā)動物模型。
我們做動物模型一般使用球蟲強毒攻毒作為壞死性腸炎的誘發(fā)因素,這樣對腸道損傷會比較嚴重,細胞破裂、腸道出血、蛋白質(zhì)泄漏在腸腔中,這些就很容易觸發(fā)產(chǎn)氣莢膜梭菌的增殖。產(chǎn)氣莢膜梭菌增殖速度很快,同時產(chǎn)生大量的毒素,對腸道的破壞非常嚴重。球蟲強毒感染作為誘因,加上產(chǎn)氣莢膜強毒株攻菌比較容易制備動物模型,有時還可以加入高蛋白的影響因素。
如用球蟲疫苗的話,需要大量攻蟲。
網(wǎng)友
林老師,有沒有針對雞壞死性腸炎的替抗防治方案?
林瑞慶
這個問題提的非常好,大家都知道要禁抗,很多人也都在嘗試一些替代方案,但有好有壞,很難一一評估。
壞死性腸炎的最大誘因是球蟲病,所以要防控好壞死性腸炎,就需要防控好球蟲病。球蟲防控方法有藥物和疫苗,因為藥物的耐藥性嚴重,加上藥物殘留等公共衛(wèi)生問題,球蟲藥防控有明顯局限性。而目前我國球蟲疫苗的應(yīng)用非常廣泛,取得的效果也非常好,完全可以替代抗球蟲藥,所以長遠來看球蟲可以考慮疫苗防控。
壞死性腸炎常繼發(fā)于球蟲病,因為原來抗生素促生長劑的應(yīng)用抑制了壞死性腸炎的發(fā)生,所以基本上很少見,現(xiàn)在禁抗之后作為一種“復(fù)燃的疾病”變成很常見了。這樣在疫苗控制球蟲病的前提下,用什么來控制產(chǎn)氣莢膜梭菌呢?考慮到我國禁抗后還允許使用球蟲藥,而球蟲藥里有幾種離子載體類抗生素,這類抗球蟲藥實際上對梭菌是一種非常好的防治藥物,在國外已經(jīng)普遍用來防控雞壞死性腸炎。所以我們就提出一個策略,小雞階段用疫苗免疫控制球蟲,消除或減輕壞死性腸炎誘發(fā)因素,然后因為產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的壞死性腸炎一般發(fā)病會較遲,所以在中、大雞階段用離子載體類抗生素控制梭菌。壞死性腸炎的防控關(guān)鍵是維護腸道健康,如能精細化管理,保證優(yōu)質(zhì)的飼料和水源等,減少環(huán)境病原,不用藥一樣也可以,另外蛋雞等不能用抗生素的,可考慮對梭菌有效的替抗產(chǎn)品與球蟲疫苗組合。我國因為飼養(yǎng)環(huán)境復(fù)雜,有很多地方區(qū)域產(chǎn)氣莢膜梭菌病原還是廣泛存在的,球蟲疫苗 離子載體類藥物聯(lián)防球蟲病和壞死性腸炎我認為也是比較好的防控方案,供大家參考使用。
網(wǎng)友
林老師,怎么能有效預(yù)防?萬一感染后怎么有效治療?
林瑞慶
有效的預(yù)防就是不讓產(chǎn)氣莢膜梭菌有萌發(fā)增殖的機會,維護腸道健康,消除誘因。有效治療先要正確診斷,然后是要用對藥物。最近有一個場發(fā)生了壞死性腸炎,但是誤判為球蟲病,使用球蟲藥沒效,后正確診斷后用地美硝唑和阿莫西林這些抗梭菌藥后才控制了病情,所以辯證很重要。因為產(chǎn)氣莢膜梭菌的耐藥性非常嚴重,一旦發(fā)生,用對藥才能控制住,在不了解該區(qū)域菌株耐藥性的情況下用藥往往難以取得好的效果。
網(wǎng)友
林老師,防控方案是要周期性的做嗎?還是根據(jù)季節(jié)不同,采取不同方案呢?
林瑞慶
我建議長期做。因為梭菌廣泛存在,之前是抗生素促生長劑的使用得到良好的控制。而從去年國家執(zhí)行飼料端禁抗后雞產(chǎn)氣莢膜梭菌分離率開始升高,很多臨床發(fā)病場的陽性也比較高。加上這個病也受季節(jié)影響,跟球蟲病相似高溫高濕的天氣要格外關(guān)注,根據(jù)可能的誘因采取相應(yīng)防控措施。
網(wǎng)友
林老師,微生物制劑,對這種腸道疾病有效果嗎?哪種效果更好呢?
林瑞慶
益生菌在預(yù)防壞死性腸炎尤其是亞臨床型壞死性腸炎方面有一定效果,對腸道黏膜有修復(fù)作用及對腸道微生物平衡有積極作用。有些益生菌對產(chǎn)氣莢膜梭菌增殖確實有抑制作用,比如丁酸梭菌等產(chǎn)品,會對產(chǎn)氣莢膜梭菌有比較好的防控作用,益生菌的作用不在于治療,而是在預(yù)防或者藥物治療之后用以恢復(fù)腸道菌群穩(wěn)態(tài)效果比較好。
網(wǎng)友
林老師,在分離培養(yǎng)的時候,怎樣才能避免被雜菌污染呢?
林瑞慶
首先采樣步驟非常重要,采樣時一定要注意避免交叉污染和環(huán)境污染。單獨換手套,重復(fù)使用的器械要消毒等。另外,對于產(chǎn)氣莢膜梭菌的樣品要新鮮,雞死亡后會有其他梭菌大量增殖,分離出來的就不單是致病病原,會干擾檢測。
第二是具體操作要規(guī)范。
第三是分離方法。不同方法的分離率和抗雜菌干擾能力是不一樣的。之后希望大家掌握分離技術(shù)加入抗梭菌的行動中。
網(wǎng)友
林老師,分離出來細菌,后續(xù)如何進行藥敏試驗?選取藥敏藥物?
林瑞慶
我們一般會先了解養(yǎng)殖戶常用藥物及考慮使用什么藥物,然后進行評估。一般使用牛津杯法,藥物有些可溶,有些需使用超聲波處理,但基本上可以找到溶劑處理,形成液態(tài)藥物使用牛津杯法。對臨床分離的菌株,這算是一個比較好的評估方法。實驗室分離的細菌都會做MIC實驗,更偏向于大量菌株耐藥性分析這樣的情況。通常對于分離的某一個菌株用牛津杯法可以比較簡單地判斷出對某些藥物的耐藥性。
網(wǎng)友
林老師,藥敏LB瓊脂菌株厭氧培養(yǎng)生長不好有什么原因?
林瑞慶
偶爾也有這種情況,一是跟菌株的活力有關(guān),長期存放的菌株有可能長不起來;另外可能跟菌株的純化有關(guān),如菌株不純,有其他雜菌,會影響實驗;還有就是厭氧環(huán)境,設(shè)備儀品和實驗方法要盡量保證培養(yǎng)的厭氧環(huán)境。
網(wǎng)友
林老師,七種分型的多重PCR方法有么?
林瑞慶
七種毒素基因分型都有各自的引物。多重PCR有時效果并不好,已經(jīng)報道有5種分型的多重PCR方法,我們擴增的效果是不如單獨引物進行PCR,所以我認為七種分型臨床應(yīng)用沒有必要做多重PCR,雖然能減少一些成本和工作量,但引物越多擴增效果影響越大,單獨引物進行也是沒有問題的,而且效果更好。
網(wǎng)友
林老師,剛才說的定期監(jiān)測,能具體說一下嗎?比如監(jiān)測時機,看哪些指標(biāo)等?
林瑞慶
禁抗后腸炎問題引起更多的關(guān)注,對于雞來說,產(chǎn)氣莢膜梭菌是主要的病原之一,腸道健康數(shù)據(jù)的收集調(diào)查對疾病的防控是非常重要的。至于雞腸道健康監(jiān)測,可以設(shè)置定期監(jiān)測,對雞群進行解剖評估,我們近年一直有進行這樣的工作,定期(一般兩個月)采集不同雞場健康雞只進行剖檢,以球蟲指標(biāo)、腸炎指標(biāo)等對腸道健康情況進行評估,禁抗前后也把產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離率指標(biāo)引入,這是一個可量化的指標(biāo)。除剖檢評分外,養(yǎng)殖場普查或者可以定期采集新鮮糞便進行梭菌分離獲得相應(yīng)數(shù)據(jù),作為一個評估腸道健康的指標(biāo),特別是提示慢性的壞死性腸炎。按照我們的經(jīng)驗,基本上分離的菌株都和腸炎相關(guān),在禁抗前要分離到產(chǎn)氣莢膜梭菌比較難,而現(xiàn)在明顯腸炎的雞只梭菌分離率較高。另外,如在生產(chǎn)上應(yīng)用離子載體抗生素來防控球蟲或產(chǎn)氣莢膜梭菌的,梭菌的分離率會明顯偏低。
網(wǎng)友
林老師,牛津杯法藥敏實驗,還需要表面覆蓋無卵黃的TSC培養(yǎng)基嗎?
林瑞慶
不需要,臨床樣品分離產(chǎn)氣莢膜梭菌時才使用。
網(wǎng)友
林老師,牛津杯針對不同藥品藥敏實驗,有抑菌但菌株不明顯,菌株很薄,不密集是什么原因?
林瑞慶
這個可能和培養(yǎng)時菌株的增殖量有關(guān),菌株的活力和純度等因素影響,同樣培養(yǎng)條件下有些梭菌實際濃度較低,可能做藥敏試驗時長的稀疏。
網(wǎng)友
林老師,藥敏實驗的菌不會產(chǎn)氣正常嗎?
林瑞慶
偶爾也會出現(xiàn)這種情況,大部分是正常產(chǎn)氣,可能需要鑒定一下菌是否被污染了,如果排除了這個問題,我們也遇到過不產(chǎn)氣的現(xiàn)象。
網(wǎng)友
林老師,現(xiàn)在肉雞上能用的西藥很少,未來肉雞的用藥方向在哪里呢?
林瑞慶
藥物肯定還是疫病防控不可少的,但可以通過精細化管理、優(yōu)質(zhì)飼料還有品種的改良等減少藥物的使用,未來將少用藥用好藥;除了通過科學(xué)防控方案進行疫病防控外,藥物的效果還需更多工藝的研發(fā),達到更好的效果,很多企業(yè)也都涉及了這方面的研究。像正典的抗寄生蟲藥蟲力黑,原來需要連續(xù)幾天用藥,現(xiàn)在使用一次即可,還能降低毒性,這些都是通過工藝改進實現(xiàn)的。此外,替抗產(chǎn)品深入研究也能在疫病防控中取得良好作用?,F(xiàn)在人們對食品安全越來越重視,而面對疾病又不可避免需要用藥,只能不斷努力改進藥物和科學(xué)用藥。
網(wǎng)友
林老師,定期使用酸制劑飲水,對本病的防控意義大嗎?
林瑞慶
一些脂肪酸具有良好的抗菌活性,對腸道健康有一定的效果,對有害菌有一定的抑制作用,但對梭菌防控的意義大小不明確,如果從維護腸道健康的角度來說是有益的,維持腸道健康是防控本病的核心。
END
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