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PD-1/PD-L1 或者CTLA-4抗體療效神奇，但并不是所有患者都能從抗體的療效中獲益，例如肺癌的整體獲益患者比例不超過(guò)30%（Curr Opin Pharmacol. 2015 Aug;23:32-8.）?；诜肿訕?biāo)志物檢測(cè)的用藥指導(dǎo)，能顯著提高有效率。免疫藥物作用機(jī)理復(fù)雜，基于單一指標(biāo)的用藥檢測(cè)局限較大。目前公認(rèn)的免疫檢測(cè)標(biāo)志物類(lèi)型主要包括以下三類(lèi)：腫瘤新生抗原（TMB、MSI、HLA等）、PD-L1表達(dá)和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL，Tumor Infiltrating Lymphocyte）。而研究報(bào)導(dǎo)較多的主要是TMB和PD-L1。下面介紹兩篇關(guān)于TMB和PD-L1的研究。

一、TMB（腫瘤突變負(fù)荷）與聯(lián)合免疫治療獲益相關(guān)

Fig.1 TMB與聯(lián)合免疫治療獲益之間的關(guān)系

• 客觀緩解（CR 或PR）和持續(xù)臨床獲益（DCB；緩解或穩(wěn)定期>6個(gè)月）的患者分別相比未客觀緩解（SD或PD）和未持續(xù)臨床獲益(NDB)的患者，TMB較高；（TMB 273 VS. 114mutations和TMB 210 VS.113mutations）（Fig.1a）橫坐標(biāo)是臨床獲益分組，縱坐標(biāo)是TMB值大小。

  
  

• TMB高(>median,158mutations)的患者ORR(51% VS.13%)、DCB率(64% VS.34%)和PFS均比TMB低的患者高；（Figb、c）橫坐標(biāo)是TMB高低分組，縱坐標(biāo)是患者數(shù)目，圖中不同顏色代表獲益類(lèi)型；

  
  

• TMB與ORR和DCB之間有很強(qiáng)的相關(guān)性（Fig.1d）；ROC曲線分析，橫坐標(biāo)代表特異性，縱坐標(biāo)是靈敏度。

  
  

• 使用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中NSCLC患者的TMB值的四分位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)（四種顏色線），對(duì)本研究的患者隊(duì)列進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)各組間的PFS有顯著差異；TMB值越高，PFS越長(zhǎng)；（Fig1e）橫坐標(biāo)是治療時(shí)間，縱坐標(biāo)PFS比例，圖中不同顏色代表TMB值大小分組。

二、TMB與臨床獲益率相關(guān)性最強(qiáng)，基于新抗原負(fù)荷與TMB值顯著相關(guān)

Fig.2 TMB和計(jì)算得到的新抗原負(fù)荷之間的關(guān)系

• TMB和計(jì)算得到的新抗原負(fù)荷高度相關(guān)(spearman ρ 0.92,P<0.0001)（Fig.2），TMB越高，腫瘤產(chǎn)生的neoantigen越多，腫瘤免疫原性越強(qiáng)；橫坐標(biāo)是TMB取log值，縱坐標(biāo)是新抗原負(fù)荷預(yù)測(cè)值取log值，兩者進(jìn)行相關(guān)性分析；

  
  

• 新抗原預(yù)測(cè)：使用Topiary軟件，將突變DNA序列模擬轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)突變后蛋白質(zhì)；通過(guò)NetMHCcons模擬預(yù)測(cè)突變蛋白與病人MHC  I型親和性。結(jié)合親和力IC50<500nM被認(rèn)為候選新抗原，親和力IC50<50nM被認(rèn)定為強(qiáng)結(jié)合新抗原。

三、在療效預(yù)測(cè)指標(biāo)中，TMB與PD-L1表達(dá)是相互獨(dú)立的兩個(gè)預(yù)測(cè)因素

Fig. 3 TMB與多變量療效之間的相關(guān)性

• 在75人隊(duì)列中的70名（93%）患者中，對(duì)TMB和腫瘤PD-L1表達(dá)不同臨床療效患者中（CR/PR，完全緩解/部分緩解；SD/PD，疾病穩(wěn)定/進(jìn)展）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)和TMB之間沒(méi)有顯著相關(guān)性（Fig.3a），為兩個(gè)獨(dú)立的臨床療效預(yù)測(cè)因子；橫坐標(biāo)是TMB值大小，縱坐標(biāo)是PD-L1表達(dá)量高低，不同顏色點(diǎn)代表不同療效的患者。

  
  

• ROC曲線，在CR/PR患者中，多變量相關(guān)分析中加入PD-L1表達(dá)、組織學(xué)、吸煙狀況等變量，分析結(jié)果顯示，TMB與ORR和PFS獨(dú)立相關(guān)；圖3中實(shí)線是加入PD-L1表達(dá)、組織學(xué)類(lèi)型、吸煙狀況、身體狀況等的多變量分析，虛線是TMB單變量分析曲線（Fig.3b）；圖c中紫色實(shí)線是6個(gè)月多變量分析，紫色虛線是6個(gè)月TMB單變量分析；黃色實(shí)線是12個(gè)月多變量分析，黃色虛線是12個(gè)月單變量分析。單變量分析時(shí)兩條曲線評(píng)估接近，受其他因素影響較小，與ORR和PFS獨(dú)立相關(guān)（Fig.3c）；

  
  

• TMB高和PD-L1表達(dá)量高，雙重指標(biāo)陽(yáng)性的患者獲益最大，其次是一個(gè)指標(biāo)陽(yáng)性，獲益明顯高于雙指標(biāo)陰性的患者（Fig.3d），藍(lán)色是臨床獲益的患者數(shù)，白色是疾病進(jìn)展的患者數(shù)；橫坐標(biāo)是獲益類(lèi)型分組，縱坐標(biāo)是患者數(shù)。

以上文章對(duì)PD-1和CTLA-4聯(lián)合阻斷治療的NSCLC患者進(jìn)行全外顯子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)TMB對(duì)客觀緩解率（ORR）、持續(xù)臨床獲益（DCB）和無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）有很好的預(yù)測(cè)作用。TMB與PD-L1表達(dá)相互獨(dú)立，且為多變量相關(guān)分析中與臨床獲益關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的遺傳學(xué)特征，TMB低的NSCLC患者的緩解率相對(duì)較低。

TMB如此重要，檢測(cè)方法至關(guān)重要。檢測(cè)方法有哪些？下面研究比較了臨床常用的兩種測(cè)序方法在TMB中應(yīng)用。

大多研究采用了全外顯子測(cè)序的方法計(jì)算TMB，受到實(shí)用性的限制，無(wú)法像靶向NGS方法成為臨床常規(guī)檢測(cè)手段。本篇研究納入240例接受靶向NGS測(cè)序并接受PD-1/PD-L1治療患者樣本，一部分患者同時(shí)進(jìn)行WES和靶向NGS測(cè)序，結(jié)果用于比較兩種方法計(jì)算得出TMB的一致性。

本文中使用的靶向NGS，240例患者中，56人使用MSK-IMPACT version 1（341個(gè)基因的全部外顯子與部分內(nèi)含子），164人使用MSK-IMPACT version 2（410個(gè)基因），20人使用MSK-IMPACT version 3（468個(gè)基因）。DNA提取自腫瘤組織與配對(duì)外周血樣本。49例患者同時(shí)使用WES與MSK-IMPACT測(cè)序，WES平均覆蓋度為150X。

TMB（腫瘤突變負(fù)荷）計(jì)算方法：體細(xì)胞非同義點(diǎn)突變個(gè)數(shù)/Mb

WES和靶向NGS測(cè)序方法計(jì)算的TMB高度相關(guān)，且與臨床治療獲益相關(guān)

• 為驗(yàn)證NSCLC中，靶向NGS是否可以準(zhǔn)確定量TMB，文章同時(shí)進(jìn)行WES與靶向NGS測(cè)序的49例樣本的測(cè)序并各自計(jì)算TMB，進(jìn)行線性回歸分析，最終結(jié)果成高度正相關(guān)(Spearmanρ=0.86;P<0.001)(Fig.1a)，橫坐標(biāo)是靶向NGS計(jì)算TMB，縱坐標(biāo)是WES計(jì)算的TMB；

Fig.1 與免疫治療反應(yīng)相關(guān)的體細(xì)胞分子特征

• 根據(jù)靶向NGS結(jié)果計(jì)算的TMB，DCB組明顯高于NDB組分布（中位數(shù)，8.5 vs 6.6 SNVs/Mb; p=0.0062），CR/PR組TMB分布也明顯高于SD或者PD組（中位數(shù)，8.5 vs 6.6 vs 6.6 SNVs/Mb; p=0.0151 ）（Fig.1b），橫坐標(biāo)是臨床療效分組，縱坐標(biāo)是TMB值；

  
  

• 文章分析了隨著TMB切值的提升如何影響ICI治療的DCB率和PFS。當(dāng)把TMB按照四分位方法依次分層，發(fā)現(xiàn)DCB比例與PFS也會(huì)隨著TMB分層的提升而增加。圖c橫坐標(biāo)是百分位數(shù)，值越大，代表TMB值越高，縱坐標(biāo)是持續(xù)臨床獲益DCB緩解率（Fig.1c）；圖d橫坐標(biāo)是時(shí)間軸，縱坐標(biāo)是PFS時(shí)間，圖中不同顏色曲線是代表不同TMB值大小區(qū)間，TMB值越高，PFS越長(zhǎng)（Fig.1d）；

  
  

• NDB組的拷貝數(shù)突變比例（FGA）高于DCB組（Fig.1e），且顯著高于為ICI治療的NSCLC患者（中位數(shù)，0.16 vs 0.11, P=0.007）。FGA與ICI（免疫治療抑制劑）應(yīng)答負(fù)相關(guān)，與TMB分布正相關(guān)。橫坐標(biāo)是臨床獲益分組，縱坐標(biāo)是拷貝數(shù)突變比例值（FGA）。

大Panel靶向NGS(二代測(cè)序)可準(zhǔn)確估算TMB，隨著TMB的提升，ICI（免疫治療抑制劑治療）獲益率可能性也在升高。

1.TMB高低和PD-L1表達(dá)是相互獨(dú)立的兩個(gè)指標(biāo)，且都與臨床獲益相關(guān)。PD-L1低的，可以測(cè)一下TMB；TMB低的，可以再測(cè)一下PD-L1。                                  

2.研究發(fā)現(xiàn)，目前公布的各大常見(jiàn)腫瘤接受PD-1抑制劑治療的有效率，和TMB大小幾乎是線性關(guān)系。TMB越大，PD-1抑制劑有效率越高。(Tumor Mutational Burden and Response Rate to PD-1 Inhibition. NEJM.2017)

Fig.2 抗PD -1或抗PD-L1治療與27種腫瘤類(lèi)型的腫瘤突變負(fù)荷與客觀反應(yīng)率的相關(guān)性。

橫坐標(biāo)是每一種常見(jiàn)腫瘤中位的突變個(gè)數(shù)，也就是TMB的大小。縱坐標(biāo)是從目前已經(jīng)開(kāi)展并公開(kāi)發(fā)表的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)中，匯總出來(lái)的每一種常見(jiàn)腫瘤接受PD-1抗體治療后的有效率。比如dMMR的腸癌、非腸癌有效率都在30%-40%；最高的是皮膚鱗癌，突破了50%，最低的是胰腺癌、生殖細(xì)胞腫瘤等，有效率低于5%。每一種腫瘤都根據(jù)它的TMB大小以及對(duì)PD-1抑制劑的有效率，在圖中畫(huà)出坐標(biāo)點(diǎn)。同時(shí)用圓圈的大小，來(lái)代表樣本量的大小。

3. TMB與療效正相關(guān)的本質(zhì)源自TMB越高，腫瘤產(chǎn)生的neoantigen越多，腫瘤免疫原性越強(qiáng)。MSI和TMB的關(guān)系：MSI可以理解為T(mén)MB的一種子集、一個(gè)特例。幾乎所有MSI高度不穩(wěn)定的病人，TMB都是高的；但是反過(guò)來(lái)，TMB高的病人，并不一定都是MSI不穩(wěn)定的，還有相當(dāng)一部分病人是MSI穩(wěn)定型的。dMMR（錯(cuò)配修復(fù)缺陷）會(huì)導(dǎo)致基因修復(fù)出現(xiàn)問(wèn)題，從而編碼出更多的新抗原，TNB也越高；HLA雜合性缺失的出現(xiàn)則影響了新抗原遞呈到腫瘤細(xì)胞表面，降低了腫瘤細(xì)胞被T細(xì)胞識(shí)別的概率，進(jìn)而負(fù)向調(diào)節(jié)了免疫治療效果。

4. 多種生物標(biāo)記物的組合可能為治療效果提供更強(qiáng)的預(yù)測(cè)價(jià)值。TMB＆PD-L1表達(dá)或者TMB&HLA比TMB單用效果更好（Science. 2018 Feb 1;359（6375）：582-587）；亦有報(bào)道指出，某些基因突變可以作為用藥敏感和用藥風(fēng)險(xiǎn)的biomaker，例如B2M、JAK1/2、TP53基因突變，MDM2/4和DNMT3A基因擴(kuò)增。

5.關(guān)于TMB計(jì)算，定義為體細(xì)胞非同義點(diǎn)突變個(gè)數(shù)/Mb；而在使用全基因組測(cè)序、全外顯子組測(cè)序或者不同大小Panel的靶向NGS測(cè)序時(shí)，其計(jì)算方法并不一致，應(yīng)視具體情況給出詳細(xì)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)。