2021-11-11 14:46 | 來源: 云起IVD | 作者：閣主Pro | 查看: 3127 | 評論: 0
接著之前的文章介紹一下CRISPR/Cas在分子診斷中的應用。
一開始CRISPR多被用于基因編輯領域，這里面也發(fā)生了很多故事。因為CRISPR/Cas9具有特異性基因序列定位能力，開始有人把它用于核酸檢測。
查了一下，最早有報道的是在2016年，Pardee率先做出基于CRISPR/Cas9技術，他結合NASBA（核酸依賴性擴增），小閣以前的文章中有提到這個恒溫擴增技術，做出肉眼可見結果的POCT寨卡病毒檢測平臺。
之后，隨著Cas12和Cas13附屬切割活性的發(fā)現，和Cas9相比降低了脫靶（未嚴格按照設計要求剪切）問題，CRISPR的核酸檢測功能這幾年開始飛速發(fā)展，進入一個新階段。
這種附屬切割活性指的是，當Cas12，Cas13激活切割靶序列的同時，還會以極高的效率切割周圍的核酸片段，這相當于自帶信號放大的特點，圍繞這個特點可以設計出很多信號讀取方式。
目前常見的幾種應用，通常使用四種Cas系統(tǒng)：Cas9，Cas12，Cas13和Cas14。
① 國外CRISPR
諾獎得主的Doudna她們就利用了Cas12的附帶切割效應開發(fā)了核酸診斷試劑。原理就是用熒光淬滅基團標記游離單鏈DNA，當Cas12切割目標基因的同時也會切割周圍游離的單鏈DNA，DNA被切斷，熒光基團降解，發(fā)出熒光信號。
她們結合RPA研發(fā)出檢測HPV分型的產品，該產品稱為DETECTR，并以此為基礎成立了Mammoth猛犸公司，并把DERECTR作為診斷平臺，還提供OEM服務。
CRISPR領域著名的張峰團隊則在Cas13a系統(tǒng)中引入了恒溫擴增RPA技術，也創(chuàng)建了一個技術平臺叫SHERLOCK夏洛克，成立了家公司，也叫夏洛克。
它的主要原理包括靶基因擴增，體外轉錄成RNA，然后用Cas13a剪切，釋放熒光信號。
這個平臺DNA和RNA都能檢測。如果是DNA，則通過RPA擴增，如果是RNA，則通過逆轉錄RT-RPA擴增，然后將擴增的DNA產物用T7轉錄成RNA分子。Cas13a在gRNA的引導下切割靶RNA，同時切割周圍已經加入熒光基團的RNA，釋放熒光信號。
之后他們還研發(fā)出SHERLOCK二代，引入了另一種輔助酶Csm6，兩種酶協(xié)同效率更高信號更強，檢測靈敏度提高了3.5倍。
夏洛克二號引入了試紙條，用膠體金和生物素標記探針，通過調整探針的濃度，保證探針沒有被切割時，所有膠體金都能匯聚到質控線，一旦探針被切割，就會有膠體金越過質控線到達陽性結果線。
更進一步，他們還把三種Cas13蛋白和一種Cas12a整合在一個體系中，一個體系同時檢測4種病原體，解決了不能進行核酸多重檢測。
現有的CRISPR診斷產品選擇的擴增方式多采用等溫擴增，除采用RPA外，還常采用LAMP（Loop-mediated isothermal amplification，環(huán)介導等溫擴增）和RAA（Recombinase Aided Amplification，重組酶介導等溫擴增）。
去年夏洛克開發(fā)的產品成為首個獲得FDA認證的CRISPR檢測試劑，選用S基因和Orf1ab基因作為靶點，整個核酸檢測耗時1h，包括提取、LAMP(環(huán)介導等溫擴增）擴增、Cas13反應和試紙條檢測，檢測限低于10 copies。
除此以外，還有CRISPR結合石墨烯場效應晶體技術，CRISPR結合納米孔技術，CRISPR結合電化學傳感器技術等等，五花八門的技術，有興趣的自行了解一下。
② 國內CRISPR
國內的公司也陸續(xù)有產品獲批，已批準的產品2個，審批中的產品1個。從現有資料看，這些試劑主要分為兩種，最低檢測限在450copies-1000copies之間。
一種是采用Cas12a或Cas13a，這兩種剪切蛋白來自外購，目前還沒有自行制備的能力，另二種是國內自研的CRISPR/Cas系統(tǒng)，比如中國科學院動物研究所周琪院士團隊，其研究者采用的是CRISPR/Cas12b剪切系統(tǒng)，
首個獲得NMPA批準的是杭州眾測生物與軍事科學院軍事醫(yī)學研究院聯合研發(fā)的新型冠狀病毒2019-nCov 核酸檢測試劑盒（CRISPR免疫層析法），原理是CRISPR+RAA（重組酶介導恒溫核酸擴增），檢測N基因。
第二個獲批的是上海伯杰的恒溫CRISPR法新冠檢測試劑，還配套了專門儀器BG-Nova-X8，采用CRISPR+RPA，原理之前提過，也是檢測N基因。
除此以外，國內公司關于CRISPR檢測試劑進展的消息不斷，可以預見未來一兩年國內也會井噴式出現各種CRISPR+恒溫擴增的檢測產品。
從目前的進展來看，綜合國外的報道，基于現有的技術開發(fā)出CRISPR的檢測平臺大概只需要2周左右。
綜上，基于CRISPR/Cas開發(fā)的核酸檢測技術相比于傳統(tǒng)的分子診斷技術，主要有以下幾個方面的優(yōu)點：
1.操作簡單，不依賴復雜的設備和嚴格的實驗室條件，結果讀取簡單。
2.成本低，目前國外報道DETECTR單測試成本低于1美元，比國外傳統(tǒng)的PCR試劑成本還低。
3.檢測速度快，一般在幾十分鐘到1小時內完成。
4.靈敏度高，經過不斷的完善，現在的靈敏度可以達到fmol級別。
5.多重檢測，設計不同的Cas針對不同的靶基因可以實現多重檢測，CRISPR在多重檢測中有巨大的潛力。
總結一句話，既有POCT的簡單速度快，又有中心實驗室的結果準，成本還低，想不火都難。
當然，也有局限性，比如脫靶效應，會造成檢驗結果的假陰性或者假陽性，這點隨著研究的深入也在逐步解決。
總的來看，CRISPR/Cas這把魔剪不但給基因治療領域帶來革命性改變，也給基因檢測領域帶來突破性進展。
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