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IHC與PCR檢測MSI的異同之差異篇

2021.07.21

目前檢測癌細胞中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定時，既可以通過檢測MMR基因缺失來確定是否發(fā)生MSI，如依賴于免疫組化技術(shù)的蛋白水平檢測，也可以直接檢測MSI的序列變化，如聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)檢測等的分子水平檢測^[1]。通過IHC檢測MMR蛋白的表達與基于DNA分析檢測MSI狀態(tài)是評估相同生物學(xué)效應(yīng)的不同檢測方法^[2-3]。檢測4種MMR蛋白（MLH1、 MSH2、MSH6和PMS2）的表達與基于DNA的MSI檢測的一致率>90%，具有很高的特異性和敏感性^[4-7]。一些研究顯示MMR免疫組化和MSI分子檢測之間不一致情況大約在1%到10%之間^[8-10]。

AnaVelasco等發(fā)起的一項覆蓋44個臨床中心，1301例結(jié)直腸癌FFPE組織樣本的研究顯示，Idylla?MSI與實驗室常規(guī)IHC方法的一致率為96.39% (988/1025)，Idylla?MSI與實驗室常規(guī)分子方法的一致率98.01%(789/805)。此外Idylla?MSI的失敗率0.23% (3/1301)低于IHC的失敗率4.37% (47/1075)和其它分子方法的失敗率0.86% (7/812)^[11]。Karen Zwaenepoel等的一項330例結(jié)直腸癌樣本的研究顯示，與1.2版Promega MSI分析系統(tǒng)相比,Idylla?MSI檢測的總體一致性、靈敏度和特異性分別達到了99.7%、98.7%和100%。Promega MSI分析系統(tǒng)檢測到7例樣本無效，而Idylla?MSI檢測系統(tǒng)只檢測到2例樣本無效。與IHC相比,Idylla?MSI檢測的總體一致性、靈敏度和特異性分別為98.7%、 94.4%和100% ^[12]。

雖然分子檢測MSI與IHC檢測MMR具有很高的一致性，但仍然有少數(shù)的不一致現(xiàn)象，主要可能有以下原因：

1. IHC未能檢測所有MMR基因變異。目前已發(fā)現(xiàn)人類MMR系統(tǒng)中含有9個錯配修復(fù)基因（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6、EPCAM、MLH3、PMS1、EXO1等）。IHC通常只檢測了其中4種MMR基因（MLH1、MSH2、MSH6及PMS2）^[13-14]。

2.IHC雖然陽性，但是MMR蛋白功能缺失。原因之一是錯義突變導(dǎo)致的蛋白催化功能缺失但是保持抗原完整性。另一種IHC雖然陽性，但是MMR蛋白功能或活性缺陷的生物學(xué)原因之一是其它次要蛋白替代PMS2和MSH6缺失(MSH3替代MSH6, MLH3或PMS1替代PMS2)。因此強烈推薦同時或序貫檢測四種抗體。約 10% MMR功能缺陷的CRC患者IHC 結(jié)果顯示為陰性( 蛋白表達正常)^[15]。

3.技術(shù)原因?qū)е碌募訇幮越Y(jié)果。主要是由于組織固定不當?shù)阮A(yù)分析問題。此外還能出現(xiàn)細胞質(zhì)、點樣或核周染色等異常染色。使用內(nèi)部陽性對照，如正常粘膜、淋巴細胞或基質(zhì)細胞是保證檢測結(jié)果的重要條件^[15]。

4.MMR判讀經(jīng)驗對結(jié)果的影響。病理學(xué)IHC檢測應(yīng)強調(diào)標本處理的規(guī)范，采用機器( 自動化) 方法與人工判讀相結(jié)合，并需有良好的質(zhì)控和內(nèi)參，其中主要是人工判讀部分容易存在問題。浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院袁瑛教授等將免疫組化和一代測序也做了方法比對，結(jié)果顯示常規(guī)病理科醫(yī)生報告得到的dMMR報告結(jié)果和一代測序結(jié)果的吻合率非常低，約為50%；而如果是高年資、經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生對免疫組化切片進行復(fù)核，并排除假陰性結(jié)果，與一代測序結(jié)果的吻合率則高達92%。所以，國內(nèi)MSI檢測共識中特別強調(diào)，如果采用免疫組化方法，讀片醫(yī)生的陽性判讀經(jīng)驗是非常關(guān)鍵的問題，另外免疫組化切片預(yù)處理流程的標準化也值得重視^[13、16]。

簡單總結(jié)主要有以下兩種情況^[17]：

1.dMMR VS MSS:①某些MMR蛋白的缺失，被功能代償，如MSH6蛋白被MSH3蛋白功能代償。②MLH1啟動子甲基化導(dǎo)致的腫瘤異質(zhì)性，從而影響結(jié)果判斷。

2.pMMR VS MSI-H:①某些MMR蛋白發(fā)生錯義突變，損失了MMR功能，但仍存在相應(yīng)抗原被抗體檢測識別。因此，在檢測MMR的過程中，其并未發(fā)生缺失，還是可以被檢測出，實際上功能已經(jīng)喪失，而發(fā)生MSI的情況。②由四種基因以外的其他基因引起的MSI，如POLE/POLD。

因此，當發(fā)生上述情況時應(yīng)首先排除實驗操作因素和主觀判斷因素。

在日常臨床實踐中需要特別注意MMR或MSI錯判導(dǎo)致免疫檢查點抑制劑無效的情況。Romain Cohen等的一項研究發(fā)現(xiàn)，在38例MSI-H或dMMR的mCRC患者中，5例（13%）對免疫檢查點抑制劑原發(fā)耐藥。復(fù)查發(fā)現(xiàn)其中3例被錯誤診斷為MSI-H或dMMR。他們又分析了93例回顧性樣本，發(fā)現(xiàn)其中9例（10%）被錯誤診斷為MSI-H或dMMR^[18]。因此ESMO共識建議同時使用MMR-IHC和MSI-PCR評估轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌或者其它林奇綜合征相關(guān)癌癥的免疫檢查點抑制劑治療篩選^[15]。

參考資料

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[12] Zwaenepoel K, et al. Clinical Performance ofthe Idylla MSI Test for a Rapid Assessment of the DNA Microsatellite Status inHuman Colorectal Cancer. J Mol Diagn. 2020 Mar;22(3):386-395.

[13] 結(jié)直腸癌及其他相關(guān)實體瘤微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測中國專家共識(2019年）.

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[15] Luchini C, et al. ESMO recommendations onmicrosatellite instability testing for immunotherapy in cancer, and itsrelationship with PD-1/PD-L1 expression and tumour mutational burden: asystematic review-based approach. Ann Oncol. 2019 Aug 1;30(8):1232-1243

[16] https://mp.weixin.qq.com/s/u9U7IfA74K9Ihvqtc7NjrQ

[17] https://mp.weixin.qq.com/s/XKvTmc4RmMqlehtBgIeABw

[18] Cohen R, et al. Association of primaryresistance toimmune checkpoint inhibitors in metastaticcolorectal cancer with misdiagnosis of microsatellite instability or mismatchrepair deficiency status. JAMA Oncol 2018.

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