·論著·

口腔幽門(mén)螺桿菌基因定量測(cè)定方法的建立及其應(yīng)用評(píng)價(jià)*

別明江1 嚴(yán)謹(jǐn)2 王保寧1 謝艷2 祝捷3 王馨田4 王紅仁1 李明遠(yuǎn)1 楊靖5 李尤玲6

(1. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2. 四川大學(xué)華西醫(yī)院消化內(nèi)科, 四川 成都 610041；3. 四川萬(wàn)可泰生物技術(shù)有限責(zé)任公司，四川 成都 610041；4. 成都樹(shù)德中學(xué)，四川 成都 610031；5. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院感染性疾病科，湖北 十堰 442000；6. 十堰巿人民醫(yī)院中西結(jié)合科，湖北 十堰 442000)

【摘要】目的 建立一種通過(guò)口腔唾液的特異、靈敏測(cè)定幽門(mén)螺桿菌核酸DNA的熒光定量PCR方法，并對(duì)其進(jìn)行臨床比對(duì)評(píng)價(jià)，為快速、準(zhǔn)確、無(wú)創(chuàng)檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌感染提供新方法。方法 以高度保守的幽門(mén)螺桿菌16s rRNA序列為靶序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)Blast軟件對(duì)相似序列比對(duì)后，篩選出一對(duì)最優(yōu)并與常見(jiàn)胃腸道細(xì)菌無(wú)交叉反應(yīng)的引物；用熒光定量PCR擴(kuò)增，對(duì)引物的退火溫度及反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，確立反應(yīng)條件；用已知菌落數(shù)(CFU/ml)的幽門(mén)螺桿菌菌懸液與唾液混合，梯度稀釋擴(kuò)增測(cè)試后進(jìn)行靈敏度分析，建立幽門(mén)螺桿菌菌落數(shù)(CFU/ml)和熒光定量PCR循環(huán)數(shù)(Ct)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；用乳酸桿菌、金黃色葡萄球菌、奈瑟氏菌、小齒類(lèi)桿菌和唾液鏈球菌的基因進(jìn)行特異性分析；利用此方法對(duì)150例來(lái)自臨床胃鏡中心的已完成尿素酶(URT)測(cè)定，并自愿參加研究者的口腔唾液標(biāo)本進(jìn)行收集檢測(cè)，結(jié)果與同一病人的14C呼氣實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，計(jì)算陽(yáng)性率、陰性率和符合率。結(jié)果 本檢測(cè)方法的引物退火溫度是62℃，反應(yīng)體系10μl；對(duì)幽門(mén)螺桿菌的檢測(cè)敏感度為102CFU/ml；本檢查與乳酸桿菌、金黃色葡萄球菌、奈瑟氏菌、小齒類(lèi)桿菌和唾液鏈球菌無(wú)交叉反應(yīng)；本方法與14C呼氣實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果比較靈敏度74.12%，特異度86.15%，符合率79.33%，Kappa值為0.59。結(jié)論 建立了口腔唾液幽門(mén)螺桿菌基因檢測(cè)的分子診斷方法；該方法的特異性好，靈敏度高，為臨床檢測(cè)口腔幽門(mén)螺桿菌提供了一個(gè)無(wú)創(chuàng)、方便的新方法。

【關(guān)鍵詞】唾液； 幽門(mén)螺桿菌； 基因； 定量檢測(cè)

幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori，簡(jiǎn)稱Hp)與慢性胃炎、胃腺癌以及胃黏膜相關(guān)性淋巴瘤(GMAT,Gastric mucosa associated lymphoma)等有著密切的聯(lián)系，在胃潰瘍(GU, stomach ulcer)和十二指腸潰瘍(DU, duodenal ulcer)患者中幽門(mén)螺桿菌感染率約90%，檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌的感染具有重要醫(yī)學(xué)意義[1,2]。我國(guó)的平均感染率約60%，尤其是不斷出現(xiàn)新的耐藥幽門(mén)螺桿菌菌株及反復(fù)復(fù)發(fā)，大大加劇了患者的長(zhǎng)期治療負(fù)擔(dān)[3-5]。目前臨床上檢測(cè)方法分為侵入性和非侵入性兩大類(lèi)，侵入性方法主要包括胃鏡取胃粘膜組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)、培養(yǎng)法、快速尿素酶試驗(yàn)(RUT, rapid urease test)及血清抗體檢測(cè)等；非侵入性方法包括14C/13C呼氣試驗(yàn) (14C/13C-UBT, 14C/13C-urea breath test)、唾液抗體、尿液抗體和糞便抗原檢測(cè) (HpSA, Hp stool antigen)等[6-9]。上述方法中不同程度存在操作復(fù)雜、檢測(cè)滯后、靈敏度不高、有創(chuàng)傷等缺點(diǎn)，建立一種無(wú)創(chuàng)、快捷、準(zhǔn)確的幽門(mén)螺桿菌檢測(cè)方法是眾多學(xué)者研究的目標(biāo)。近年P(guān)CR技術(shù)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中顯示出了特異、敏感、快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于包括幽門(mén)螺桿菌在內(nèi)的各種病原微生物的檢測(cè)[10]。已證實(shí)口腔是幽門(mén)螺桿菌的重要存儲(chǔ)庫(kù)，可定居舌苔、牙菌斑、牙周袋等部位，口腔幽門(mén)螺桿菌的存在和口腔疾病及胃內(nèi)幽門(mén)螺桿菌感染具有高度的相關(guān)性[11-13]。基于此，在前期調(diào)查研究的基礎(chǔ)上[13-17]，本研究利用Hp保守基因序列16s rRNA設(shè)計(jì)特異性引物，檢測(cè)口腔唾液中的幽門(mén)螺桿菌，對(duì)Hp感染快速準(zhǔn)確無(wú)創(chuàng)檢測(cè)，進(jìn)一步研究口腔幽門(mén)螺桿菌感染和胃內(nèi)幽門(mén)螺桿菌治療后復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 幽門(mén)螺桿菌悉尼株(Helicobacter pylori Sydney strains，來(lái)自于河北醫(yī)科大學(xué))，大腸桿菌、乳酸桿菌、金黃色葡萄球菌、奈瑟氏菌、小齒類(lèi)桿菌和唾液鏈球菌由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室提供。

1.1.2 口腔唾液樣本 取自四川大學(xué)華西醫(yī)院消化內(nèi)科14C呼氣實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的自愿患者，簽訂知情同意書(shū)后，用無(wú)菌脫脂棉簽在口腔磨牙外側(cè)，壓緊擦劃5次，取出后放入采樣管中，蓋好瓶蓋，做好標(biāo)記。

1.1.3 試劑及培養(yǎng)基 Bacterial DNA Kit 購(gòu)自O(shè)MEGA公司；SYBR? Premix Ex TaqTM，購(gòu)自TAKARA公司；Primer由寶生物工程有限公司合成；COLUMBIA BLOOD AGAR BASE購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；無(wú)菌小牛血清購(gòu)自明海生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器 XZ-21K高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；CFX-96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自Bio-Rad公司；KD5600DNA/RNA蛋白分析儀購(gòu)自成都榮海生物；PYS-DHS恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠；BSC-4EX生物安全柜購(gòu)自成都榮海生物；YQD-6厭氧罐購(gòu)自榮海生物。

1.2.2 幽門(mén)螺桿菌的培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 取幽門(mén)螺桿菌菌種接種于哥倫比亞血平板上，于微需氧條件下37℃培養(yǎng)48h，用PBS洗脫細(xì)菌，在578nm波長(zhǎng)下測(cè)定菌液濁度，然后依次10倍梯度稀釋，取100μl菌液涂布在哥倫比亞血平板上按上述培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)后計(jì)數(shù)(濃度單位為CFU/ml)，計(jì)算出菌液濁度與CFU/ml之間的關(guān)系。另取上述不同梯度的菌液1ml，煮沸裂解作為幽門(mén)螺桿菌基因模板。

1.2.3 幽門(mén)螺桿菌引物設(shè)計(jì) 根據(jù)幽門(mén)螺桿菌16s rRNA基因序列，用Primer Express 3.0 設(shè)計(jì)特異性引物；在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast /)中經(jīng)Blast軟件對(duì)相似序列比對(duì)后，篩選最優(yōu)的且與常見(jiàn)胃腸口腔微生物無(wú)交叉反應(yīng)的一套引物。

1.2.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化 采用20μl反應(yīng)體系，退火溫度分別為56℃、58℃、60℃、62℃、64℃時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖電泳分析，確定最佳退火溫度；采用最佳退火溫度，反應(yīng)體系分別為5 μl、10 μl、20 μl、30 μl、40 μl、50 μl時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖電泳分析，確定最佳反應(yīng)體系。

1.2.5 特異性和靈敏度 分別用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、輪狀病毒，白色念球菌等常見(jiàn)微生物進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)；取已計(jì)數(shù)過(guò)的幽門(mén)螺桿菌菌懸液人為加入唾液煮沸裂解，然后10倍梯度稀釋，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，確定檢測(cè)方法的靈敏度。

1.2.6 臨床評(píng)價(jià) 取經(jīng)14C呼氣實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的病人口腔唾液樣本，煮沸處理后，取上清進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果與14C檢測(cè)結(jié)果比較，計(jì)算符合率。

2 結(jié)果

2.1 退火溫度 在退火溫度56～62℃時(shí)，擴(kuò)增目的條帶明亮且無(wú)引物二聚體，優(yōu)化的退火溫度62℃，見(jiàn)圖 1。

圖1 退火溫度的優(yōu)化

Figure 1 Electrophoretic analysis of the PCR products amplified by different annealing temperature

注：M為Marker；1～6.為56℃、58℃、60℃、 62℃、 64℃和66℃陽(yáng)性； 7～12.為56℃、58℃、60℃、62℃、64℃和66℃陰性

2.2 反應(yīng)體系 優(yōu)化的退火溫度為62℃，采用不同體系擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)體系在5～20μl時(shí)(本文選擇10μl體系)，擴(kuò)增目的條帶明亮，擴(kuò)增相對(duì)于其余體積效果好，見(jiàn)圖2。

圖2 反應(yīng)體系的優(yōu)化

Figure 2 Electrophoretic analysis of the PCR products amplified using different volume

注：M.Marker；1～6.分別為5 μl、10 μl、20 μl、30 μl、40 μl、50 μl反應(yīng)體系擴(kuò)增的陽(yáng)性條帶；7～12.分別為5 μl、10 μl、20 μl、30 μl、40 μl、50 μl反應(yīng)體系擴(kuò)增的陰性對(duì)照

2.3 特異性 按上述優(yōu)化好的最佳條件，以幽門(mén)螺桿菌、乳酸桿菌、金黃色葡萄球菌、奈瑟氏菌、小齒類(lèi)桿菌和唾液鏈球菌基因做為反應(yīng)模板，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)只有幽門(mén)螺桿菌基因擴(kuò)增出特異性條帶，證明該引物具有較好的特異性，見(jiàn)圖3。

按上述優(yōu)化好的最佳條件，以幽門(mén)螺桿菌、乳酸桿菌、金黃色葡萄球菌、奈瑟氏菌、小齒類(lèi)桿菌和唾液鏈球菌基因做為反應(yīng)模板，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)僅幽門(mén)螺桿菌有擴(kuò)增曲線，而其它模板及陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線,見(jiàn)圖4、圖5。

圖3 特異性檢測(cè)

Figure 3 Electrophoretic analysis of the specificity

注：M.Marker; 1.乳酸桿菌; 2.金黃色葡萄球菌; 3.奈瑟氏菌; 4.小齒類(lèi)桿菌;5.唾液鏈球菌基因; 6.陰性對(duì)照; 7.幽門(mén)螺桿菌

圖4 采用不同菌株模板進(jìn)行PCR反應(yīng)的擴(kuò)增曲線

Figure 4 Amplification curve of real time PCR using different templates

2.4 靈敏度 將已經(jīng)計(jì)數(shù)后的幽門(mén)螺桿菌加入一定唾液，10倍梯度稀釋模擬人口腔樣本，煮沸裂解后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得出該方法的檢測(cè)靈敏度為102CFU/ml。

圖5 采用Hp不同模板濃度進(jìn)行PCR反應(yīng)的擴(kuò)增曲線

Figure 5 Amplification curve of real time PCR using templates with different concentration

注：1～7.107CFU/ml、106 CFU/ml、105 CFU/ml、104 CFU/ml、103 CFU/ml、102 CFU/ml和101 CFU/ml;8.為陰性對(duì)照

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線 將已經(jīng)計(jì)數(shù)后的幽門(mén)螺桿菌人為加入一定唾液后10倍梯度稀釋，按上述方法擴(kuò)增，循環(huán)數(shù)為Y，對(duì)應(yīng)的幽門(mén)螺桿菌菌落數(shù)(CUF/ml)取對(duì)數(shù)后值為X， 對(duì)應(yīng)函數(shù)為：y=-3.24x+28.689，曲線圖(見(jiàn)圖6)。該對(duì)應(yīng)函數(shù)為定量標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)，見(jiàn)表 1。

圖6 菌落數(shù)對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Figure 6 The curve for the colony form units of Hp corresponding the PCR cycle numbers

2.6 臨床應(yīng)用評(píng)價(jià) 本方法與14C呼氣實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病人結(jié)果比較，靈敏度為74.12%，特異度86.15%，符合率79.33%，Kappa=0.59(見(jiàn)表 2)。表內(nèi)數(shù)據(jù)顯示，口腔唾液、胃組織幽門(mén)螺桿菌的感染有一定的關(guān)系，150例臨床自愿者口腔與胃組織檢測(cè)結(jié)果之間的一致性分析顯示Kappa值為0.59，高于0.4，低于0.75，顯示有一致性。提示口、胃幽門(mén)螺桿菌的感染不僅僅是一個(gè)感染事件，而且是有一定相關(guān)性的感染事件?？谇慌c胃幽門(mén)螺桿菌的同時(shí)檢測(cè)和治療對(duì)幽門(mén)螺桿菌引起的胃炎、潰瘍的防治有重要意義。本檢測(cè)方法為口腔幽門(mén)螺桿的檢測(cè)提供了簡(jiǎn)單有效，靈敏特異的新方法。

表2 熒光定量PCR與14C呼氣實(shí)驗(yàn)(URT)檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌的比較

Table 2 Comparison of real time PCR with 14C (URT)in detection of Helicobacter pylori

3 討論

自1983年幽門(mén)螺桿菌被澳大利亞學(xué)者Warren和Marshall發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已被證實(shí)與胃癌等疾病有著密切的關(guān)系[1-2,4]。1989年Krajden等[18]成功從胃炎患者牙菌斑和唾液中分離出幽門(mén)螺桿菌后，學(xué)者們相繼發(fā)現(xiàn)口腔內(nèi)的幽門(mén)螺桿菌和胃內(nèi)幽門(mén)螺桿菌基因型具有高度相關(guān)性[11-13,18]，通過(guò)檢測(cè)口腔內(nèi)幽門(mén)螺桿菌，從而對(duì)胃幽門(mén)螺桿菌感染做出診斷具有了科學(xué)依據(jù)。近年來(lái)不斷有人嘗試檢測(cè)口腔內(nèi)的幽門(mén)螺桿菌來(lái)反映胃內(nèi)感染情況，比如口腔唾液幽門(mén)螺桿菌檢測(cè)試劑板，口腔幽門(mén)螺桿菌抗原檢測(cè)等，但還需進(jìn)一步改進(jìn)方法并進(jìn)入臨床應(yīng)用[19-22]。

本研究根據(jù)幽門(mén)螺桿菌16s rRNA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，成功建立了口腔唾液幽門(mén)螺桿菌基因定量檢測(cè)方法(實(shí)時(shí)熒光定量PCR)。用C14檢測(cè)法從胃檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌感染陽(yáng)性85例，同時(shí)用口腔唾液PCR法檢測(cè)口腔幽門(mén)螺桿菌感染者63例，占胃陽(yáng)性率的74.12%,而胃幽門(mén)螺桿菌感染陰性65例，用口腔唾液PCR法從口腔檢測(cè)出幽門(mén)螺桿菌者9例，占胃陰性率的13.85%,說(shuō)明口腔唾液檢測(cè)胃幽門(mén)螺桿菌感染對(duì)胃幽門(mén)螺桿菌的感染有一致性，但口腔唾液與胃幽門(mén)螺桿菌的感染狀況不完全相同，口腔唾液檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌的基因檢測(cè)是對(duì)幽門(mén)螺桿菌感染檢測(cè)的有益補(bǔ)充。本檢測(cè)方法與臨床胃幽門(mén)螺桿菌檢測(cè)方法(URT)的差異分析：在幽門(mén)螺桿菌感染初期可能只有口腔中有而胃中沒(méi)有，或者胃中幽門(mén)螺桿菌感染的量少時(shí)口腔可能沒(méi)有，又或者胃里感染嚴(yán)重時(shí)口、胃均有。具體有待臨床進(jìn)一步研究。本研究中用該方法檢測(cè)已經(jīng)完成14C檢測(cè)胃幽門(mén)螺桿菌的感染的同一樣的口腔唾液樣本，雖然2個(gè)部位取樣，但兩個(gè)檢測(cè)結(jié)果的符合率為80.13%，kappa值為0.59，說(shuō)明口腔唾液幽門(mén)螺桿菌的感染與胃幽門(mén)螺桿菌的感染有一定的一致性，但不完全一致。

本方法用棉簽攢取待檢者口腔唾液，樣本直接煮沸后，僅需10 μl直接加樣檢測(cè)，可對(duì)最低100個(gè)幽門(mén)螺桿菌菌體檢出，其檢測(cè)不需要采集胃粘膜、血液等有創(chuàng)取樣，減少了樣本制備難度，縮短了檢測(cè)時(shí)間。本方法通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)了對(duì)幽門(mén)螺桿菌檢測(cè)的定量化，解決了幽門(mén)螺桿菌菌體難以定量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)室困難，為臨床口腔幽門(mén)螺桿菌的感染診斷和治療評(píng)估提供了高敏度，易實(shí)現(xiàn)的好方法。數(shù)據(jù)顯示口、胃幽門(mén)螺桿菌的感染均存在，但口胃幽門(mén)螺桿菌感染與口腔幽門(mén)螺桿菌的定植有何關(guān)系以及其進(jìn)化和衍進(jìn)過(guò)程，本課題組正在進(jìn)一步的研究和探索。

4 結(jié)論

本文資料顯示，口腔唾液幽門(mén)螺桿菌基因定量測(cè)定方法具有特異性好、靈敏度高、可定量、無(wú)創(chuàng)傷、檢測(cè)方便等特點(diǎn)，是幽門(mén)螺桿菌感染檢測(cè)的新方法。本方法的建立和評(píng)估為臨床進(jìn)行口腔幽門(mén)螺桿菌的定量檢測(cè)及幽門(mén)螺桿菌的治療評(píng)估提供相關(guān)的數(shù)據(jù)和檢測(cè)手段?？蛇M(jìn)一步完善臨床評(píng)價(jià)和標(biāo)準(zhǔn)的試劑盒化，為臨床提供幽門(mén)螺桿菌新的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)試劑盒。

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Establishment and application evaluation of quantitative detection method of Helicobacter pylori in oral cavity

BIE Mingjiang1,YAN Jin2,WANG Baoning1,XIE Yan2,ZHU Jie3,WANG Xintian4,WANG Hongren1,LI Mingyuan1,YANG Jing5,LI Youling6

(1.Department of Microbiology,College of Basic and Forensic Medicine, Sichuan university, Chengdu 610041, China;2.Department of Digestive Internal medicine, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China;3. Sichuan Vaccine Biotechnology Co. Ltd., Chengdu 610041, China;4.Chengdu Shude Middle School, Chengdu 610031, China;5. Department of Infectious Disease, Renmin Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei, China;6. Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Renmin Hospital,Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei, China)

【Abstract】Objective To establish a simple, specific, sensitive PCR method with oral saliva sample to detect Helicobacter pylori and evaluated the sensitivity and specificity for detection of the helicobacter pylori infection in the clinical field. Methods Primers and probes were designed by corresponding to the converse 16s rRNA gene sequences and which were matched by Blast method in Genebank and then. The excellent primers and probes were selected. Electrophoretic analysis of the PCR products was amplified by different annealing temperature and different reaction system. The best reaction conditions were determined. The counted Hicobacter pylori in bacterium suspension and oral saliva mixture were serially diluted. The gene was extracted, and amplificated by real time PCR. The sensation was evaluated, and the standard curve of the colony form unit (CFU) counts corresponding to the real time PCR cycle numbers were established. The genes of pathogens, such as Lactobacilli strain, Saphylococcusaureus, Neisseriaceae, B. denticola and S. salivarius were used for specificity test. The saliva samples of 150 patients were detected by real time PCR and compared the results with the URT. Results The primer annealing temperature at 62℃ and reaction volume was 10μl. Its sensitivity was able to detect 102 CFU/ml of Hicobacter pylori and no cross reaction with Lactobacilli strain, Saphylococcusaureus, Neisseriaceae, B. denticola and S. salivarius. The sensitivity compared with URT was 74.12%, specificity was 86.15%, the coincidence rate was 79.33% and Kappa was 0.59,respectively. Conclusion A new gene saliva diagnosis method to Helicobacter pylori was established. The limit of detection(LOD) to Hicobacter pylori was 102CFU/ml and no cross reaction with other pathogens. The sample was saliva which could give the doctor a new sensitive, specific, rapid, noninvasive and available diagnostic tool to detect Helicobacter pylori in oral cavity.

【Key words】Oral cavity; Helicobacter pylori; Gene; Quantitative detection

基金項(xiàng)目：四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2014JY0201)；湖北醫(yī)藥學(xué)院研究生啟動(dòng)金資助計(jì)劃項(xiàng)目(2015QDJZR08)；十堰市科技局研究與開(kāi)發(fā)專項(xiàng)基金項(xiàng)目(16K70)；成都市科技局重點(diǎn)科研項(xiàng)目(2014-CP02-00079-GX)

通訊作者：王保寧，博士，E-mail:danial.w@163.com；楊靖，博士，碩士生導(dǎo)師，E-mail：yangjing780228@foxmail.com

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 573.6

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2017.01.004

(收稿日期：2016-08-01； 編輯： 陳舟貴)