【【核酸研究】RNA錯剪接與疾病】http://toutiao.com/group/6300969831126810882/?iid=15906422033&app=explore_article×tamp=1520010336&tt_from=copy_link&utm_source=copy_link&utm_medium=toutiao_ios&utm_campaign=client_share
導語
人類轉(zhuǎn)錄組是由一個龐大的RNA集合組成，它們經(jīng)過RNA剪接進一步多樣化。在這個巨大的序列池中負責監(jiān)測序列特異性剪接位點由主要剪接體(major spliceosome)和少數(shù)剪接體(minor spliceosome)及其大量的剪接因子相互作用完成。剪接復合物功能屬性決定了它對于序列多態(tài)性和缺失突變較為敏感。RNA錯剪接（RNA mis splicing）引起了大量的人類疾病。本文通過討論疾病相關的錯誤闡述RNA剪接機制以及突變引起剪接體調(diào)控的抑制，探討調(diào)控間接治療的策略。
RNA剪接（RNA splicing ）簡介
RNA剪接（RNA splicing）：從DNA模板鏈轉(zhuǎn)錄出的最初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中除去內(nèi)含子，并將外顯子連接起來形成一個連續(xù)的RNA分子的過程。
內(nèi)含子內(nèi)特定腺苷的2'羥基攻擊5'剪接位點，從而形成一個套索。5'外顯子的3'羥基新親核基于3'剪接位點引發(fā)第二次的交酯化/轉(zhuǎn)酯化反應，從而將兩個外顯子接合。
無論是對組成型剪接還是對可變剪接而言，剪接位點的識別是一個核心問題。剪接位點的確定和剪接調(diào)控主要由2個異常活躍的大分子機器來完成：
主要剪接體(major spliceosome)：U2型依賴，它由U1、U2、U4、U6和U5 snRNPs 組成，識別一類相對罕見的GT-AT類內(nèi)含子(即U2 類內(nèi)含子)
少數(shù)剪接體(minor spliceosome)：U12型依賴，它由U11、U12、U4atac、U6atac和U5 snRNPs 組成，識別一類相對罕見的AT-AC類內(nèi)含子(即U12 類內(nèi)含子)
剪接位點的識別受到許多順式調(diào)控元件與反式調(diào)控因子的控制。順式調(diào)控元件通常是很短且保守的RNA順序，它們普遍存在于基因組中。根據(jù)它們在基因中的位置以及對剪接的作用，分為外顯子剪接增強子或抑制子(exonic splicing enhancer or silencer,ESE or ESS)以及內(nèi)含子剪接增強子或抑制子(intronic splicing enhancer or silencer,ISEorISS)。在對順式調(diào)控元件進行的早期研究中，主要采用對報告基因進行突變分析的方法。
在大多數(shù)情況下，反式調(diào)控因子能夠結(jié)合存在于mRNA前體中的順式調(diào)控元件，在mRNA前體上形成復合物，并通過改變剪接體在mRNA前體上的組裝達到對剪接位點進行高度特異性地識別。目前已知的剪接調(diào)控蛋白有SR蛋白家族、核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP)家族以及諸如TIA-1、Fox1/2、Nova1/2、CELF、RBM5、YB-1等蛋白。SR蛋白家族成員是由位于氨端的一個或二個RNA識別結(jié)構(gòu)域(RNA recognition motifs，RRMs)和位于羧端的富含絲氨酸和精氨酸的RS結(jié)構(gòu)域(RSdomain)組成的。SR蛋白可與富含嘌呤的剪接增強子結(jié)合，促進U1和U2snRNP與剪接位點的結(jié)合，并招募U4/U6/U5snRNP三聚體到剪接體上。hnRNP蛋白家族成員都擁有RNA識別結(jié)構(gòu)域(RRMs)和由氨基酸簇所構(gòu)成的輔助區(qū)域。hnRNP蛋白通常識別剪接抑制子，從而抑制剪接位點的選擇和利用。mRNA前體的二級結(jié)構(gòu)也會對剪接位點的選擇產(chǎn)生影響。RNA的二級結(jié)構(gòu)可以暴露或遮掩剪接信號或順式調(diào)控元件，或通過影響剪接調(diào)控元件之間的距離調(diào)控剪接位點的識別變外顯子兩側(cè)的序列相互配對，形成“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)，使處于環(huán)部的外顯子順序不被剪接體所識別。
可變剪接的方式
可變剪接主要有7 種方式：(1)外顯子的包含和跳躍；(2)5'剪接位點的選擇性利用；(3)3'剪接位點的選擇性利用；(4)外顯子互相排斥地引入；(5)內(nèi)含子去除或保留；(6)啟動子和第一個外顯子的可變剪接；(7)多聚腺苷位點與最后一個外顯子的可變剪接
疾病相關的剪接體改變
《RNA mis-splicing in disease》，Nature Reviews,doi:10.1038/nrg.2015.3 Published online 23 Nov 2015
可變剪接是增加基因組多樣性的重要機制，也是在生理與病理條件下調(diào)控哺乳動物細胞基因表達的重要步驟。越來越多的數(shù)據(jù)顯示剪接調(diào)控的紊亂與疾病的發(fā)生密切相關。
Lamin A(LMNA) pre-mRNA異常剪接與多種遺傳疾病相關。正常外顯子以藍色表示，內(nèi)含子以厚黑線表示，正常剪接以薄黑線表示，疾病相關的剪接以點線或者紫條表示（內(nèi)含子殘留）
a，b，c，b代表4種遺傳疾病由特定剪接位置的突變改變了單一外顯子的錯誤剪接造成。
在腫瘤中剪接體失調(diào)
可變剪接是增加基因組多樣性的重要機制，也是在生理與病理條件下調(diào)控哺乳動物細胞基因表達的重要步驟。越來越多的數(shù)據(jù)顯示剪接調(diào)控的紊亂與疾病的發(fā)生密切相關。
做圖為主要剪接體：剪接步驟、核心剪接體組分，它們與剪接前體復合物（complex A）和剪接體（complex C）
右圖為次要剪接體：剪接步驟、核心剪接體組分，它們與剪接前體復合物（complex A）和剪接體（complex C）
mRNA前體加工因子3（Pre-mRNA processing factor 3 ，PRPF3），mRNA前體加工因子4（Pre-mRNA processing factor 4 ，PRPF4），mRNA前體加工因子6（Pre-mRNA processing factor 6 ，PRPF6）,mRNA前體加工因子8（Pre-mRNA processing factor 8 ，PRPF8）,mRNA前體加工因子31（Pre-mRNA processing factor 31 ，PRPF31）為U4/U6.U5三小核糖核蛋白組成成分，在常染色體顯性視網(wǎng)膜色素變性（autosomal dominant retinitis pigmentosa，adRP)中失調(diào)。SNRNP200螺旋酶在剪接體循環(huán)中的幾個解離步驟中是必須的。幾種PRPF組分在the U4/U6.U5 tri-snRNP和the U4atac/U6atac.U5 tri-snRNP complexes中相同的。U4atac snRNA的5’莖環(huán)突變在嚴重的發(fā)育障礙——稱為Taybi-Linder綜合癥或microcephalic osteodysplastic primordial dwarfism 1（是家族性侏儒的一型，表現(xiàn)有小頭畸形、精神發(fā)育不全、出生時體重不足、骨的異常，特別是手足的長短骨），和一種遺傳性腸息肉病Peutz-Jeghers綜合癥。應激誘導p38 MAPK的上調(diào)會導致U6atac穩(wěn)定性的增加（t1/2 <2 hours）。
共轉(zhuǎn)錄因子召募和疾病突變
a）剪接因子在核質(zhì)識別并結(jié)合到RNA聚合酶II（RNA Pol II）轉(zhuǎn)錄本或者直接結(jié)合到RNA PollII的C末端結(jié)構(gòu)域（arboxy-terminal domain，CTD)。這些因子包含RNA結(jié)合基序，比如RNA識別基序（RNA recognition motifs，RRMs)或鋅指（zinc fingers ，ZnFs）以及由低復雜度的輔助結(jié)構(gòu)域（low complexity,LC），包括hnRNPA1,TDP-43,FUS,MBNL。剪接因子也可以與單鏈RNA（single-stranded RNA,ssRNA）基序或者成型前體RNA結(jié)構(gòu)（G-quadruplexes）,由此形成動態(tài)的RNA-PNP復合體在細胞核輸出之前連續(xù)的通過RNA螺旋酶和蛋白與蛋白相互作用進行變構(gòu)。
b）hnRNPA1, TDP?43和FUS的LC區(qū)域突變引起RNA-RNP復合物的錯誤折疊導致異常剪接。
c）微衛(wèi)星的擴張引起的疾?。杭艚右蜃覯BNL在重復序列中識別一個基序，由此引起重復序列的擴張，單鏈區(qū)域，RNA發(fā)夾形成扣留了蛋白因子最終導致功能的喪失和錯誤的剪接。
錯誤剪接疾病的治療策略
錯誤剪接引起的疾病治療策略主要介紹反義核酸和小分子方法。
a）杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）患者中，Eteplirsen可以在超過2年的時間內(nèi)安全地維持其對行走速度的有益作用，并且是首個能在這一時間段內(nèi)穩(wěn)定膈肌功能的藥物。Eteplirsen是一種用于治療肌萎縮蛋白外顯子51缺失（產(chǎn)生無功能的肌萎縮蛋白）患者的藥物。該藥是一種電荷中性磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸（PMO），用于占13%的攜帶該突變的DMD患者，通過與肌萎縮蛋白pre-mRNA外顯子51結(jié)合而引導肌萎縮蛋白基因的選擇性剪接。縮短但仍有功能的肌萎縮蛋白（比如在貝克肌營養(yǎng)不良癥中觀察到的蛋白）的轉(zhuǎn)錄和翻譯由此得以恢復。
b)SMA是一種運動神經(jīng)元疾病，其會導致控制肌肉和隨意運動的神經(jīng)發(fā)生退化，這些神經(jīng)元往往需要一種名為運動神經(jīng)元存活（SMN）的蛋白來維持功能；正常情況下所有細胞中都會包含兩種蛋白SMN1和SMN2的突變體的指令，在健康的病人中SMN1是非常充足的，而由于分子編輯的問題往往會使得SMN2出現(xiàn)短缺不穩(wěn)定的形式。
在SMA患者中，由于產(chǎn)生SMN1的指令發(fā)生錯誤，往往會使得細胞不再產(chǎn)生SMN1蛋白，因此細胞就會依賴于SMN2來行使自己的功能；研究者Adrian Krainer教授表示，我們開發(fā)了一種新型藥物，其可以進行正確的編輯，增加神經(jīng)元細胞中功能性SMN2蛋白的水平，這種名為反義寡核苷酸（ASO）的藥物分子在臨床前治療SMA小鼠模型中表現(xiàn)出了極大的潛力，如今研究人員正在進行SMA病人的臨床III期研究。
研究者表示，ASO可以直接運輸?shù)絊MA患兒的腦脊髓液中，大量研究表明SMN對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)非常重要，因此研究人員如今都在致力于研究如何增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)中全長的SMN的水平。本文研究中研究者開發(fā)了一種新方法，其僅可以在大腦周圍組織中恢復SMN的產(chǎn)生；隨后研究者利用皮下注射ASO的方式來治療SMA模型小鼠，結(jié)合以前的研究結(jié)果，研究人員發(fā)現(xiàn)，ASO可以增加新生小鼠機體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍組織中的SMN的水平，而且通過皮下注射的部分ASO還可以到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)來有效治療小鼠模型的疾病。
c)ASO Gamper治療強直性肌營養(yǎng)不良癥：Rochester大學醫(yī)學中心、Isis制藥公司和Genzyme公司的科學家通過反義寡核苷酸治療，在小鼠肌肉細胞中消除了一類有害的RNA，成功逆轉(zhuǎn)了強直性肌營養(yǎng)不良癥的癥狀。
強直性肌營養(yǎng)不良癥是一類最普遍的肌營養(yǎng)不良癥，約有35,000美國人患有強直性肌營養(yǎng)不良癥。這種遺傳疾病患者的肌肉會逐漸萎縮和僵硬，最終難以行走、吞咽和呼吸?；颊叩难劬?、心臟和大腦也會受到影響。盡管有藥物可以改善其中一些癥狀，但目前沒有藥物能夠停止這一疾病的發(fā)展。
約在十年前，科學家就發(fā)現(xiàn)這種疾病的基因缺陷的致病機制與其他遺傳疾病存在很大的差異。在絕大多數(shù)遺傳疾病中，一個基因突變意味著一個重要蛋白的合成出錯，或者根本無法合成。
而強直性肌營養(yǎng)不良癥的基因突變產(chǎn)生了一種在細胞核中累積的異常信使RNA，它會介入并阻礙其他蛋白起作用。其中一個受到影響的蛋白是MBNL1，該蛋白幫助構(gòu)建氯離子通道，對于肌肉的電信號控制非常重要。該蛋白受到影響使肌肉發(fā)出錯誤的電信號從而引發(fā)強直性肌營養(yǎng)不良癥的相關癥狀。
科學家根據(jù)強直性肌營養(yǎng)不良癥的致病機制，利用體內(nèi)一個負責將RNA切成片段的酶，開發(fā)了一種合成化合物。這種反義寡核苷酸藥物是帶有化學修飾的短片段DNA，它能與有害RNA結(jié)合，其上的化學修飾使之能成為機體RNase H酶的作用目標。
研究人員建立了1型強直性肌營養(yǎng)不良癥DM1的小鼠模型，對其進行反義寡核苷酸藥物實驗。研究顯示DM1致病突變產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本對于反義鏈沉默特別敏感。反義寡核苷酸藥物能快速knockdown小鼠骨骼肌中的有害RNA，成功逆轉(zhuǎn)了小鼠的癥狀，使有害RNA的水平減少了超過80%，顯著減輕了肌肉的僵硬程度，改善了肌肉的顯微結(jié)構(gòu)，使肌肉中的電信號回歸正常。并且在治療中斷后該效果維持了1年。
研究還發(fā)現(xiàn)，全身性的反義寡核苷酸治療手段，也能在肌肉中成功knockdown Malat1(在核中積累的lncRNA)。研究為反義寡核苷酸治療提供了一個一般性的策略。
研究人員指出，該治療藥物能否對患者有效還言之過早。不過，鑒于強直性肌營養(yǎng)不良癥的致病機制對于反義寡核苷酸治療特別敏感，且該藥物對小鼠模型中極為有效，他們對此持謹慎樂觀的態(tài)度。
“研究結(jié)果顯示了反義寡核苷酸治療手段可以從根本上治愈疾病，這給我們以極大的鼓舞，這是相當重要的一步，”文章資深作者，Rochester大學醫(yī)學中心的神經(jīng)學家Charles Thornton博士說，他從事強直性肌營養(yǎng)不良癥的新藥開發(fā)研究已經(jīng)有二十多年。
“不過，現(xiàn)在就斷言這一治療方法會不會在人體中也同樣起作用還為之過早。在生物醫(yī)學研究中就曾經(jīng)出現(xiàn)過藥物在小鼠中起作用但對人體不起作用的先例，”
這種化合藥物被稱為“antisense”是因為其基因序列是目標RNA鏈的反義鏈。這種反義鏈化合物只會精確的與強直性肌營養(yǎng)不良癥基因的RNA結(jié)合，而不會影響其他成千上萬的重要RNA。
環(huán)狀RNA的起源與pre-mRNA剪接競爭
《circRNA Biogenesis Competes with Pre-mRNA Splicing》，Molecular Cell,Volume 56, Issue 1, p55–66, 2 October 2014
環(huán)狀RNA的產(chǎn)生經(jīng)常與mRNA共轉(zhuǎn)錄
環(huán)狀RNA生成率主要通過內(nèi)含子序列調(diào)控
環(huán)狀RNA生成與正式的pre-mRNA剪接相互競爭
muscleblind與側(cè)翼內(nèi)含子相互作用促進外顯子環(huán)化
長鏈非編碼RNA Gomafu調(diào)控精神分裂癥相關的RNA剪接
《The long non-coding RNA Gomafu is acutely regulated in response to neuronal activation and involved in schizophrenia-associated alternative splicing》Molecular Psychiatry，(2013), 1–9
Gomafu是否通過與剪接因子結(jié)合而引起精神分裂癥相關基因的可變剪接呢？
已有文獻報道稱，Gomafu能夠和剪接因子SF1結(jié)合，作者猜想，Gomafu是不是通過與剪接因子結(jié)合而調(diào)控DISC1和ERBB4的可變剪接呢。為證實這個猜想，作者選用人類蛋白質(zhì)組芯片，尋找能夠與Gomafu結(jié)合的蛋白。
研究者對人類神經(jīng)元進行刺激后，用人類蛋白質(zhì)組芯片進行檢測，篩選到了和Gomafu相互作用的剪接因子，包括SRSF1和QKI，其中QKI與Gomafu的結(jié)合最強。
作者用電泳遷移率檢測（EMSA），也證實了QKI能夠與Gomafu結(jié)合。而且，已有報道稱，剪接因子QKI與精神分裂癥的發(fā)病緊密相關。
圖例：Gomafu直接和剪接因子QKI結(jié)合
a：QKI最可能和Gomafu相結(jié)合
b：EMSA檢測表明Gomafu和QKI相互作用
Gomafu相關的可變剪接模型
結(jié)合以上的實驗結(jié)果，并借鑒LncRNA—MALAT1作為腳手架結(jié)合蛋白，從而調(diào)控基因表達的模型，研究者提出一個Gomafu相關的可變剪接的模型：當神經(jīng)元沒被激時，Gomafu作為一個支架，結(jié)合多種剪接因子，且這個復合物限制在核中特定區(qū)域；當神經(jīng)元接受刺激而激活后，Gomafu表達下調(diào)，剪接因子自由地釋放，從而引起精神分裂癥相關的基因的可變剪接。
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