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植物在正常條件下，游離脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低溫、鹽堿等逆境時(shí)，游離脯氨酸便會(huì)大量積累，并且積累指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)。因此，脯氨酸可作為植物抗逆性的一項(xiàng)生化指標(biāo)。

【原理】

采用磺基水楊酸提取植物體內(nèi)的游離脯氨酸，不僅大大減小了其他氨基酸的干擾，快速簡(jiǎn)便，而且不受樣品狀態(tài)（干或鮮樣）限制。在酸性條件下，脯氨酸與茚三酮反應(yīng)生成穩(wěn)定的紅色縮合物，用甲苯萃取后，此縮合物在波長(zhǎng)520nm處有一最大吸收峰。脯氨酸濃度的高低在一定范圍內(nèi)與其消光度成正比。

【儀器與用具】

分光光度計(jì)；水浴鍋；漏斗；20ml大試管數(shù)支；20ml具塞刻度試管9支；5～10ml注射器或滴管。

【試劑】

3%磺基水楊酸水溶液；甲苯；

2.5%酸性茚三酮顯色液：冰乙酸和6mol/L磷酸以3︰2混合，作為溶劑進(jìn)行配制，此液在4℃下2～3日有效；

脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱(chēng)取25mg脯氨酸，蒸餾水溶解后定容至250ml，其濃度為100μg/ml。再取此液10ml用蒸餾水稀釋至100ml，即成10μg/ml的脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。

【方法】

    1．標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作

表38-1  各試管中試劑加入量

    （1）取7支具塞刻度試管按表38-1加入各試劑?；靹蚝蠹硬Ａ蛉诜兴屑訜?/span>40min。

（2）取出冷卻后向各管加入5ml甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜置待分層后吸取甲苯層以“0”管為對(duì)照在波長(zhǎng)520nm下比色。

（3）以消光值為縱坐標(biāo)，脯氨酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求線(xiàn)性回歸方程。

2．樣品測(cè)定

    （1）脯氨酸提取  取不同處理的剪碎混勻小麥葉片0.2～0.5g（干樣根據(jù)水分含量酌減），分別置于大試管中，加入5ml 3%磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃球，于沸水浴中浸提10min。

（2）取出試管待冷卻至室溫后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml顯色液，于沸水浴中加熱40min，下一步操作按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制做方法進(jìn)行甲苯萃取和比色。

（3）結(jié)果計(jì)算：從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中查出測(cè)定液中脯氨酸濃度，按下式計(jì)算樣品中脯氨酸含量的百分?jǐn)?shù)。

脯氨酸（μg/g FW或DW）=

式中  C—提取液中脯氨酸濃度（μg），由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得；

V—提取液總體積（ml）；

a—測(cè)定時(shí)所吸取的體積（ml）；

W—樣品重（g）。

    【思考題】

    1.植物體內(nèi)游離脯氨酸測(cè)定有何意義？

2.當(dāng)改變萃取劑時(shí)，比色應(yīng)做哪些改變？如何選擇最適波長(zhǎng)？如何選擇最佳萃取劑？