線粒體是細(xì)胞內(nèi)較獨(dú)特的細(xì)胞器，因?yàn)樗鼈兙哂歇?dú)立于細(xì)胞核DNA的遺傳物質(zhì)——線粒體DNA。與此同時(shí)，線粒體也是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝與能量代謝中心，被稱為細(xì)胞的“能量工廠”。線粒體功能缺陷被認(rèn)為是導(dǎo)致多種包括代謝性及退行性疾病、心血管疾病、衰老和癌癥的重要因素 。線粒體DNA（mtDNA，mitochondrial DNA）呈雙鏈環(huán)狀，共編碼37個(gè)基因，其中包括13種電子傳遞鏈酶復(fù)合物亞基、22種tRNA和2種rRNA。mtDNA的完整性是維持細(xì)胞乃至機(jī)體正常功能的基本要求。迄今為止，盡管人們對(duì)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)有了比較全面的認(rèn)識(shí)，但是對(duì)于mtDNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等過程的了解還比較有限。mtDNA由 DNA聚合酶γ復(fù)制。然而，在mtDNA復(fù)制的起始階段，合成單鏈RNA引物的引物酶仍不清楚。

分子生物學(xué)的“中心法則”解釋了生物系統(tǒng)內(nèi)遺傳信息的流動(dòng)。生物體以DNA的形式存儲(chǔ)遺傳信息，以RNA的形式攜帶遺傳信息，最后將遺傳信息轉(zhuǎn)化為執(zhí)行細(xì)胞功能的蛋白質(zhì)。從基因到蛋白質(zhì)的旅程在每個(gè)細(xì)胞內(nèi)都受到嚴(yán)格且精準(zhǔn)的控制，而這種準(zhǔn)確性在線粒體DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的背景下尤為重要。近年來，越來越多的研究主要圍繞mtDNA復(fù)制如何高保真及修復(fù)，還沒有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)tDNA轉(zhuǎn)錄過程是否存在校對(duì)，可能還有未知的機(jī)制有待發(fā)現(xiàn)。

在最新的這項(xiàng)工作中，作者在果蠅中創(chuàng)建了線粒體RNA聚合酶 (PolrMT) 基因敲除突變體。在缺失PolrMT的果蠅幼蟲中，利用胸苷類似物EdU原位標(biāo)記mtDNA的合成，發(fā)現(xiàn)PolrMT基因敲除突變體無法復(fù)制mtDNA（圖1）。此外，作者利用大腸桿菌體系表達(dá)并純化PolrMT，在M13噬菌體基因組DNA作為模板的體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)中，相較于T7 RNA聚合酶，PolrMT不僅可以產(chǎn)生長度超過1,000個(gè)核苷酸的長鏈RNA，還能形成長度小于100個(gè)核苷酸的短鏈RNA。因此，PolrMT具備為mtDNA復(fù)制提供RNA引物的條件。

圖1: PolrMT對(duì)mtDNA的復(fù)制必不可少

為了深入揭示PolrMT如何在mtDNA復(fù)制過程中發(fā)揮作用，作者通過體外表達(dá)及純化一系列截短突變蛋白進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)，果蠅PolrMT的PPR結(jié)構(gòu)域?qū)ζ浜铣啥替淩NA并起始mtDNA的復(fù)制不可或缺。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PPR結(jié)構(gòu)域具有核糖核酸外切酶活性（圖2）。在以DNA-RNA雜合雙鏈為底物反應(yīng)時(shí)，PPR結(jié)構(gòu)域可以特異性地降解RNA鏈直至保留最后5個(gè)核糖核苷酸，而這長度為5個(gè)核苷酸的短鏈RNA恰好成為啟動(dòng)mtDNA復(fù)制的引物。

圖2: PPR結(jié)構(gòu)域是3’-5’核糖核酸外切酶

通過系統(tǒng)的定點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)，作者成功篩選出單一位點(diǎn)突變蛋白PolrMT^E423P，該突變蛋白不再具有核糖核酸外切酶活性，但保留PolrMT的轉(zhuǎn)錄活性。在果蠅成蟲時(shí)期過表達(dá)PolrMT^E423P蛋白，會(huì)導(dǎo)致果蠅出現(xiàn)早衰表型，其中包括行動(dòng)力下降，對(duì)機(jī)械應(yīng)力易感和壽命縮短等。在體外利用錯(cuò)配的 DNA-RNA雜合雙鏈為底物，作者發(fā)現(xiàn)野生型的PolrMT依賴PPR結(jié)構(gòu)域的核糖核酸外切酶活性，可以有效且快速的移除錯(cuò)誤配對(duì)的RNA堿基。通過對(duì)線粒體轉(zhuǎn)錄組的高通量測(cè)序及分析，作者證實(shí)過表達(dá)PolrMT^E423P蛋白并不影響正常的mtDNA轉(zhuǎn)錄和加工過程，然而，線粒體轉(zhuǎn)錄本的錯(cuò)配率卻顯著提高（圖3）。以上結(jié)果首次闡釋PolrMT在線粒體轉(zhuǎn)錄過程中可能的校對(duì)機(jī)制。

圖3: PolrMT對(duì)mtDNA轉(zhuǎn)錄有校對(duì)功能

mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄對(duì)細(xì)胞的能量代謝至關(guān)重要。該研究首次揭示了果蠅PolrMT合成mtDNA復(fù)制必需的RNA引物的分子機(jī)制，為深入理解線粒體DNA的復(fù)制機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。此外，該研究首次發(fā)現(xiàn)并闡釋了果蠅PolrMT通過具有核糖核酸外切酶活性的亞基PPR結(jié)構(gòu)域，進(jìn)行剪切化學(xué)反應(yīng)以校對(duì)mtDNA的轉(zhuǎn)錄。綜上研究成果拓寬了人們對(duì)線粒體DNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過程的認(rèn)知，為理解和發(fā)展線粒體疾病治療帶來了重要啟示。

編輯 | 余   荷