SMAD4 Somatic Mutations in Head and Neck Carcinoma Are Associated With Tumor Progression
頭頸鱗狀細胞癌中SMAD4 體細胞突變與腫瘤進展相關
頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC），包括口腔鱗狀細胞癌，是全球第六大最普遍的惡性腫瘤。 HNSCC的發(fā)病機制受許多分子因素的影響，TCGA的全外顯子測序（WES）顯示HNSCC中具有顯著突變的新基因。
SMAD4是SMAD家族的轉錄因子，其參與TGF-β信號傳導。在過去20年研究中發(fā)現僅SMAD4功能喪失并不能引發(fā)腫瘤，但可能會促進由其他分子缺陷（如KRas的激活）引發(fā)的腫瘤的進展。SMAD4的喪失在對DNA損傷的反應中起著至關重要的作用。
這項工作中，研究了HNSCC中的SMAD4突變。發(fā)現SMAD4的突變及其表達水平與HNSCC的進展有關，并影響患者的生存。
數據
122個手術切除的HNSCC樣本（Mackay Memorial Hospital，中國臺灣），術前均未接受放療或輔助化療。血液和癌組織中提取DNA。
結果
一、SMAD4的體細胞突變和LOH
1. 為了評估SMAD4在臨床患者中的表現，對122個HNSCC患者的SMAD4基因進行測序（NGS）和雜合性缺失（LOH）分析。在患者中識別到了SMAD4的7個體細胞突變，其中2個是同義突變，5個是錯義突變（圖1A,B）。在28(22.95%)個患者中，至少發(fā)現一個LOH標志（本工作使用三個接近SMAD4 位點的多態(tài)性標志：D18S363,D18S474和D18S46），17(13.93%)個患者中有2或3個LOH標志（圖1A）。90個患者沒有突變或LOH。
圖1.HNSCC患者中SMAD4突變及LOH情況
2. 相比淋巴結未轉移患者，有淋巴結轉移的患者的突變、LOH頻率高（圖2C）。在臨床分級、腫瘤大小、嗜神經侵襲、淋巴血管滲透上沒有顯著區(qū)別（圖2A-E）。對患者劃分兩組（SMAD4野生組、SMAD4突變或LOH或既突變又LOH組）進行生存分析，結果顯示，有SMAD4突變或LOH的患者生存差（圖2F-G）。COX回歸分析顯示SMAD4突變或LOH的患者有較差的DFS和OS（表1）。
圖2.SMAD4 LOH和突變的臨床/病理學參數比較及生存分析
表1.SMAD4 LOH和突變相關的COX回歸分析
二、SMAD4在HNSCC患者中的表達
在癌旁正常口腔上皮細胞、腫瘤細胞中分別檢測SMAD4表達（圖3A），在腫瘤組織中，SMAD4的表達從弱到強不等。研究發(fā)現SMAD4低表達與臨床分期、腫瘤大小、淋巴結轉移相關（圖3B-G）。SMAD4的表達與LOH和突變狀態(tài)、嗜神經侵襲和淋巴血管滲透無關。生存分析顯示SMAD4低表達患者生存差（圖3H，I）。但是多變量Cox回歸分析顯示，SMAD4表達與OS之間的相關性僅略顯著。
圖3.SMAD4 表達相關的臨床/病理學參數比較及生存分析
三、SMAD4敲除與增加HNSCC侵襲能力的關聯(lián)性
SMAD4在正常的人類口腔角質細胞（NOKs）和HNSCC細胞中的蛋白表達（圖4A）。57.1%的HNSCC細胞系相比于NOKs有表達降低或者沒有蛋白表達的情況。
為了進一步闡明SMAD4的致癌作用，在SAS和SCC25這兩個HNSCC細胞系中敲除SMAD4（圖4B），發(fā)現敲除SMAD4沒有影響細胞增殖（圖4C，F），但細胞遷移和入侵顯著增加（圖4D,E,G,H）。
圖4.SMAD4 敲除相關分析
四、SMAD4突變與增加HNSCC侵襲能力的關聯(lián)
為了表征SMAD4對表型的影響，從SAS細胞系中擴增出SMAD4的全長編碼區(qū)，并克隆得到SMAD4結構體。在腫瘤樣本中，SMAD4有三個錯義突變 (p.His132Tyr,p.Pro296Thr, and p.Ala488Val)，這些突變分別位于MH1、Linker和MH2區(qū)域（圖5A）。
在FaDu和 OECM1（沒有或者只有低SMAD4表達）細胞系中構建SMAD4突變，濕實驗研究SMAD4表達變化（圖5B,C）。外源的SMAD4表達減少了FaDu和OECM1細胞系的遷移和入侵(圖5E,F,H,I)。突變體p.H132Y被轉染后，細胞系中由SMAD4過表達而抑制的表型消除了。轉染的細胞系增殖率未被影響 (圖5D,G)。然而，p.P296T和p.A488V突變體并沒有消除SMAD4過表達對入侵和遷移的挽救作用。
圖5.構建SMAD4突變型的表達相關分析
這篇文章的主要內容就是這些，讓我們再來回顧一下整個研究。由于SMAD4的分子功能喪失與腫瘤密切相關，所以研究人員從該基因入手對122個HNSCC腫瘤進行分析，首先評估該基因在腫瘤中突變和LOH的情況，探究其與臨床分級、腫瘤大小以及預后的關系，發(fā)現有SMAD4突變或LOH的患者生存差，同時生存分析顯示SMAD4低表達患者生存差。接下來又對SMAD4進行敲除以及對細胞系構建突變體，發(fā)現敲除會影響細胞遷移和入侵，而不同突變體對入侵和遷移的影響不同。
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