生物極客導讀：
小伙伴們大家好，今天我們生物極客公眾號，將開啟一個新的篇章，將非常詳細的以文獻Journal Club的方式，從文獻背景、研究創(chuàng)新手段、研究方法等多種手段極為細致的對文章進行分析。
今天我們選擇的文章是來自UCSF的Michael A. Fischbach 課題組16年在Cell發(fā)表的文章：“Discoveryof Reactive Microbiota-Derived Metabolites that Inhibit Host Proteases”通過對腸道微生物大規(guī)模菌群的分析，從而鑒定出來活性的基因座，可以產(chǎn)生活性分子，抑制蛋白酶活性。
這項工作，以多學科交叉的思路，從生物信息的基因組挖掘，到質譜化學生物學，然后蛋白組學等多種手段，揭開了腸道微生物菌群對宿主影響，尤其是腸道菌群分泌小分子的鑒定，具有非常深遠的影響，有鑒于此，我們將從多個方面進行深入的學習。
文獻背景：
人們已經(jīng)知道，腸道菌群對于人體有多許許多多的影響，然而在分子水平解析腸道菌群對人體宿主的影響還知之甚少，在課題組前期的工作中，他們發(fā)現(xiàn)腸道菌群中存在數(shù)千個基因座，這些基因座在NIH人類腸道菌群宏基因組計劃的大于50%樣本中都有出現(xiàn)，那么這些基因座產(chǎn)生的小分子，究竟有會什么樣的活性，為什么他們的基因會如此豐富的出現(xiàn)在腸道菌群？
為了探索這個問題，科學家們選擇非核糖體多肽合成酶基因座進行分析【nonribosomal peptide synthetase (NRPS) gene clusters】，非核糖體多肽合成酶基因座產(chǎn)生非常多的明星分子，比如我們常見的抗生素。科學家們發(fā)現(xiàn)這個基因座在多達90%的糞便樣本的宏基因組測序中都可以發(fā)現(xiàn)，而且在其他樣本中發(fā)現(xiàn)很少，說明與腸道微生物的活性息息相關。
那么這個基因座家族究竟扮演什么樣的角色？該使用什么方法探究這個問題？發(fā)現(xiàn)相應的結果？
科學發(fā)現(xiàn)脈絡：
生物信息基因座挖掘
為了研究這個基因座的生物功能，首先需要做的便是系統(tǒng)性看一看在不同的宏基因組測序樣品中，這個基因座家族究竟有著怎么樣的特征？有哪些酶，有哪些輔助的蛋白？
科學家們采取了叫做“multi-gene BLAST search ”的方法鑒定了總共47種這個家族的基因座如下圖：
在這47個基因座中，大部分是來自于anaerobic Firmicutes ,theclass Clostridia 菌中，那么如何研究這些基因座的功能那？
體外重構反應途徑
科學家們首先想到的便是直接合成這些片段，由于clostridia菌非常難于遺傳操作，因此科學家們在Ecoli和Bacillus subtilis 菌中，植入這些片段，看看當這些片段植入后，能不能得到一些新的小分子？
因此科學家們選擇了14個基因座進行合成，然后對細菌進行液相色譜質譜連用儀探究新的化合物。
液相色譜質譜聯(lián)用
科學家們發(fā)現(xiàn)，對于含有bgc35和bgc52的基因的大腸桿菌，還真的可以發(fā)現(xiàn)多個新的峰圖：
通過NMR等多種方法，科學家們發(fā)現(xiàn)這些分子大多是pyrazinones 和 dihydropyrazinones如下圖：
不過問題也來了，究竟這些新的分子是不是在原始的腸道菌群存在？
這需要從兩方面來回答，首先，是否這些基因在原始的細菌中能合成這些產(chǎn)物？第二，這些基因是否在原始的細菌中表達？
第一個問題，是否是這些基因合成的這些產(chǎn)物？怎么來回答這個問題那？最好的方法就是體外實現(xiàn)，通過添加原料，然后在體外純化的酶的促進下，可以合成相應的分子，另外驗證是否原始的菌產(chǎn)生這個產(chǎn)物。
的確如此，那么這些基因是否表達那？
通過RNA-seq便可以發(fā)現(xiàn)，科學家們發(fā)現(xiàn)這些基因位點的RNA-seq reads覆蓋度很高：
說明這些基因有明顯的表達。
那么這些產(chǎn)生的產(chǎn)物究竟有什么活性？
考慮到結構的相似性，很有可能這些小分子參與的是蛋白酶活性抑制劑。為了驗證這個猜想，科學家們首先將小分子和一些已經(jīng)報道的蛋白酶相互作用，發(fā)現(xiàn)在nM級別就非常明顯的抑制，除此之外，為了更加精細的探究蛋白酶活性在全局的作用，科學家們使用了蛋白組學，探究小分子在細胞內的靶標。
文獻創(chuàng)新點：
基于生物信息的基因組挖掘，這項技術，極大的擴寬了人們的視野，可以從更豐富的角度考慮問題。
綜合使用多種技術和手段，可以看到在這篇文章中，質譜、蛋白組學等多種手段為科學問題的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎。
寫作學習積累：
詞組積累
influence host biology in numerous ways,
at the level of molecular mechanism
the presence of thousands of biosyntheticloci of unknown function
are capable of producing
The small-molecule products of these genetic elements represent large gaps in ourknowledge of
we set out tocharacterize
These clusters attractedour attention for two rea- sons.
suggesting that the metabolites they encode are widely distributed among healthy hu- mans.
raising the possibility that their small-mole- culeproducts play a role in interspecies signaling in the gut.
they residealmost exclusively in gut bacterial genome sequences; only a few environmentalisolates harbor acluster in the family,
We began by performing a multi-gene BLAST search (Medema et al., 2013) to identifynew clusters in the family from genome se quences that had beendeposited since our previous analysis.
This search yielded 19 new clusters at a threshold of 30%average sequence identity, increasingthe size of the family to 47
It consists offour clades: one featuresa three-module NRPS (e.g., bgc52), another a two-module NRPS and a loading module on aseparate protein
As such, the only way to access these clusters is to synthesizethem,
Since none of the host organisms have been manipulatedgenetically and most are from a bacterial class (Clostridia) that is largely refractory togenetic manipulation, we decided not to make targeted genetic deletions in anyof the native host strains. Instead,
Having identified the small-molecule products of a subsetof the gut NRPS family, we nextturned to the question of how widely distributed this cluster family isin the human population.
These data werederived from a global analysis that involved mapping metagenomic reads to proteinsfrom 14,000 biosyn- thetic gene clusters (BGCs) using the fast, metagenomics-opti- mized algorithmmBLASTx
Here, we usedtwo complementary methods to determinethe abundance of the gut NRPS family in publicly available metagenomicdatasets.
we developed ahighly sensitive and specific analytical method in
we used arecently developed approachthat leverages a large gene catalog of >9 million gut microbiome genes
Together, these results confirmthat this gene cluster family is widely distributed in healthy human subjects.
文獻信息：
摘要：
The gut microbiota modulatehost biology in numerous ways, but little is known about the molec- ularmediators of these interactions. Previously, we found a widely distributedfamily of nonribosomal peptide synthetase gene clusters in gut bacteria. Here,by expressing a subset of these clusters in Escherichia coli or Bacillussubtilis, we show that they encode pyrazinones and dihydropyrazinones. At leastone of the 47 clusters is present in 88% of the National Institutes of HealthHuman Microbiome Project (NIH HMP) stool samples, and they are tran- scribedunder conditions of host colonization. We present evidence that the active formof these mole- cules is the initially released peptide aldehyde, which bearspotent protease inhibitory activity and selec- tively targets a subset of cathepsinsin human cell proteomes. Our findings show that an approach combiningbioinformatics, synthetic biology, and heterologous gene cluster expression canrapidly expand our knowledge of the metabolic potential of the microbiota whileavoiding the challenges of culti- vating fastidious commensals.
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