小分子越來越難做，大分子發(fā)展很強(qiáng)勢，似乎成為了近年來藥物研發(fā)-市場的重要表現(xiàn)之一，許多公司Boss、科研人員也因此而開始將研發(fā)方向?qū)?zhǔn)大分子生物藥。但客觀上，小分子化學(xué)藥物的開發(fā)方式在諸多方面都與生物大分子藥物存在技術(shù)上的明顯不同，快速的“跨界”，對于研發(fā)人員來說，真的很難做到。故而，介于小分子與大分子之間的“多肽”類藥物，可以說是很好的過渡轉(zhuǎn)折點。當(dāng)然，多肽類藥物絕非雞肋，從發(fā)現(xiàn)到今天，一直都是生命科學(xué)家、化學(xué)家、藥物學(xué)家關(guān)注的熱點，目前已有80多個藥物上市，且一些品種也發(fā)展成了年銷售額數(shù)十億美元的重磅炸彈，所以，無論是研發(fā)方向上的轉(zhuǎn)型，還是技術(shù)上的過渡，對于多肽類藥物的了解、深挖，都是藥物研發(fā)人員必做的功課之一！
多肽藥物的性能及特點
多肽，可以說廣泛存在于生物系統(tǒng)中，是信號分子、傳輸分子，也是消化分子。作為信號分子，多肽控制生物體的生物功能，如細(xì)胞分裂、交配、趨化性、痛覺、生長和免疫力，多肽合成已經(jīng)成為生物化學(xué)、藥理學(xué)、免疫學(xué)和生物物理研究最有力的工具之一；作為傳輸分子，多肽能促進(jìn)離子穿過細(xì)胞膜通道；作為消化分子，多肽在細(xì)胞和完整有機(jī)體的營養(yǎng)吸收中發(fā)揮重要作用。除此之外，多肽也可以作為保護(hù)劑，如具有優(yōu)良抗菌和抗病毒性能的抗生素。而現(xiàn)在，多肽是重要的商業(yè)實體，己經(jīng)被用在不同的治療領(lǐng)域，如糖尿病、過敏、抗感染、肥胖癥、診斷、腫瘤、關(guān)節(jié)炎和心血管疾病等。
由于多肽藥物主要來源于內(nèi)源性多肽或其他天然多肽，通常情況下，其結(jié)構(gòu)清楚、作用機(jī)制明確，許多性質(zhì)往往介于小分子化學(xué)藥物與大分子蛋白/抗體類藥物之間，如與小分子化學(xué)藥物相比，半衰期一般很短、不穩(wěn)定、體內(nèi)易被快速降解、制劑不穩(wěn)定須低溫保存、成本較小分子化藥高(尤其是長鏈多肽)，等等；與大分子蛋白相比，穩(wěn)定性更好一些、用量更少、單位活性更高、成本更低，且多肽的化學(xué)合成技術(shù)成熟、容易與雜質(zhì)或副產(chǎn)物分離、純度高。
上述存在的缺點，如穩(wěn)定性問題，有些多肽可通過改造修飾或者與其他材料組成穩(wěn)定的復(fù)合物；成本問題，隨著科技進(jìn)步，設(shè)備更新和工藝改善，成本已可更好控制。多肽類藥物最大的問題，其實是不能口服，主要是因為易被降解和難穿越腸黏膜，但目前也有各種可替代的其他給藥途經(jīng)如皮下注射、鼻腔噴射等。
表1：多肽、傳統(tǒng)化藥、蛋白藥物簡單對比
多肽的分類
按來源分類，多肽可分為生物活性多肽和人工合成多肽；按大小分類，可分為小肽、中等肽和大肽，小肽指含氨基酸殘基數(shù)目小于15的多肽，中等肽指含氨基酸殘基數(shù)目在15到50之間的多肽，含氨基酸殘基數(shù)目大于50的多肽稱為大肽；按結(jié)構(gòu)分類，可以將多肽分為同聚肽和雜聚肽兩種，同聚肽包含直鏈肽和環(huán)狀肽，雜聚肽包含色素肽、糖肽、脂肽和縮脂肽；按功能分類，可將多肽劃分為運(yùn)動蛋白、激素蛋白、毒蛋白、多肽激素、酶蛋白、多肽抗菌素和毒肽等。
多肽研發(fā)~代表性事件
20世紀(jì)初，F(xiàn)ischer首次合成具備特定序列的多肽
1932年，Bergmann等人使用芐氧羰基保護(hù)α-氨基，多肽合成有了一定的發(fā)展。
1953年，Vigneaud成功合成第一個多肽藥物催產(chǎn)素(oxytocin)
1963年，Merrifield用樹脂為固相載體，成功合成多肽序列，創(chuàng)立了多肽固相合成
60年代末，Merrifield發(fā)明第1臺全自動多肽合成儀，并首次合成生物蛋白酶(124aa)
70年代，腦啡肽及腦中其他阿片樣肽的相繼發(fā)現(xiàn)，使神經(jīng)肽的研究又進(jìn)入了高潮
1972年，Lou Carpino首先將FMOC用于保護(hù)α-氨基，并迅速得到廣泛使用
1984年，Merrifield因發(fā)明多肽固相合成技術(shù)榮獲諾貝爾化學(xué)獎
多肽藥物研發(fā)情況
目前全球批準(zhǔn)上市的多肽藥物已超過80余種，藥物數(shù)量主要分布于腫瘤、糖尿病、感染、免疫、心血管、泌尿等等。最初，20世紀(jì)70年代以前，每年平均不到1個多肽藥物進(jìn)入臨床試驗；70年代，每年平均大約只有1個進(jìn)入臨床試驗；而在80年代和90年代，每年平均進(jìn)入臨床試驗的大約分別為5個和10個；21世紀(jì)前10年，進(jìn)入臨床試驗的多肽藥物數(shù)量攀升，每年平均大約有17個。
多肽類藥物市場
據(jù)Transparency Market Research市場報告，2015年全球多肽藥物市場規(guī)模近200億美元，2020年將達(dá)到237億美元，2014~2020年復(fù)合增長率約為2.8%。多肽藥物主要用于治療癌癥、代謝紊亂相關(guān)的重大疾病，這些疾病相關(guān)的藥物擁有全球非常重要的市場。目前，總的來說，全球藥物市場上有超過80種多肽藥物，有200~300種多肽藥物在臨床試驗中，有500~600種正在臨床前試驗中，更多的多肽藥物在實驗室研究階段。可以預(yù)見，未來會有越來越多的多肽藥物獲FDA批準(zhǔn)進(jìn)入藥物市場。一些現(xiàn)有的多肽藥物已經(jīng)擁有可觀的消費市場。藥物品種方面，2016年居多肽類藥物銷售之首的仍為醋酸格拉替雷，連續(xù)多年的銷售額超過40億美元，緊隨其后的為利拉魯肽和生長激素，全球銷售額均超過了20億美元，在之后分別為奧曲肽、亮丙瑞林、特立帕肽、艾塞那肽、戈舍瑞林等等。
多肽藥物的獲得方法(以下主要是技術(shù)方面)
主要有3種來源，天然提取、生物、化學(xué)。
1.從天然產(chǎn)物中提取活性組分
一些天然產(chǎn)物中存在活性組分，可通過溶劑萃取法從簡單的混合物中提取出有效成分，若天然產(chǎn)物成分復(fù)雜、活性組分含量非常少，則需要利用酶解或微波輔助消解法，使蛋白質(zhì)前體降解，通過檢測設(shè)備對活性片段進(jìn)行分離和檢測，快速有效地從混合物中發(fā)現(xiàn)具有活性的小肽。
2.生物合成(基因重組技術(shù))
基因重組技術(shù)是通過將多肽的基因序列構(gòu)建到載體上，形成重組DNA表達(dá)載體，并在原核或真核細(xì)胞中進(jìn)行多肽分子表達(dá)、提取、純化。此方法適合制備大于50個氨基酸組成的目的多肽，且較易獲得。隨著基因工程生產(chǎn)多肽的技術(shù)趨于完善，加快了基因工程類多肽藥物的研制及臨床應(yīng)用的步伐。
3.化學(xué)合成(包括液相和固相兩種方法)
液相法是最先發(fā)展的多肽合成方法：其過程是將所需的氨基酸或者短肽配制成溶液，其中，一個氨基酸的氨基端和另外的氨基酸或短肽的羧基端以及不參與反應(yīng)的側(cè)鏈基團(tuán)均被化學(xué)基團(tuán)保護(hù)，而參加反應(yīng)的氨基酸或短肽的羧基則需進(jìn)行活化，然后在溶液中發(fā)生偶聯(lián)。反應(yīng)完成后，再用各種方法將沒有參加反應(yīng)的原料、活化劑等分離除去而得到純化多肽產(chǎn)物。多肽液相分段合成主要分為天然化學(xué)連接和施陶丁格連接。天然化學(xué)連接是多肽分段合成的基礎(chǔ)方法，局限在于所合成的多肽必須含半光氨酸(Cys)殘基，因而限定了天然化學(xué)連接方法的應(yīng)用范圍，天然化學(xué)連接方法的延伸包括化學(xué)區(qū)域選擇連接、可除去輔助基連接、光敏感輔助基連接；施陶丁格連接方法是另一種基礎(chǔ)的片段連接方法，其為多肽片段連接途徑開拓了更廣闊的思路，正交化學(xué)連接方法是施陶丁格連接方法的延伸，通過簡化膦硫酯輔助基來提高片段間的縮合率。
固相多肽合成法(SPPS，very important！)，是目前普遍采用的多肽合成方法：原理是將多肽序列C端的第一個氨基酸的羧基通過酯化反應(yīng)固定在不溶性的載體(樹脂+連接分子)上，然后以此氨基酸作為氨基組分，經(jīng)脫除氨基保護(hù)基團(tuán)并同過量的活化后的羧基組分反應(yīng)形成肽鍵，之后重復(fù)脫保護(hù)、縮合、洗滌操作作過程以延長肽鏈長度，從而獲得所需長度的肽鏈。最后，通過酸(如三氟乙酸)將肽鏈從樹脂上切割下來，并同時脫除所有保護(hù)基團(tuán)，經(jīng)高效液相純化處理后，即可得到所需的多肽。經(jīng)過多年的研究與發(fā)展，既克服了液相合成的費時和煩瑣，又降低了由操作帶來的損失，最大的優(yōu)點是合成中所有的純化步驟均以簡單的沖洗和過濾完成，大大減輕提純的難度，具有方便快捷、操作簡單和產(chǎn)率高的優(yōu)勢，其優(yōu)越性還表現(xiàn)為便于實現(xiàn)自動化，使其成為多肽化學(xué)合成的首選方法。
圖1：多肽合成原理示意
圖2：固相合成示意圖
圖3：固相合成技術(shù)細(xì)節(jié)
多肽合成儀
世界上第一臺真正意義上的多肽合成儀出現(xiàn)在1960年代末至1970年代初期，它是利用氮氣鼓泡來對反應(yīng)物進(jìn)行攪拌，用計算機(jī)程序控制來實現(xiàn)有限度的自動合成，代表產(chǎn)品Beckman公司推出的Beckman 990 Peptide Synthesizer和Vega’s Biotechnologies公司推出的Vega’s 296 Peptide Synthesizer；第二代多肽合成儀誕生在上世紀(jì)八十年代，代表產(chǎn)品Protein Technologies公司推出的PS3 Peptide Synthesizer以及Advanced ChemTech公司推出的ACT peptide synthesizer Model 90；第3代多肽合成儀誕生在上世紀(jì)九十年代，代表產(chǎn)品是美國Applied Biosystems公司的ABI433 peptide synthesizer與CS Bio公司的CS336無死角多肽合成儀。
圖4：3代多肽合成儀代表產(chǎn)品
多肽類藥物的質(zhì)量控制
多肽類藥物的質(zhì)量控制來自于合成的多肽類藥物，質(zhì)量研究可以參照一般的化學(xué)藥物的研究思路。質(zhì)量控制主要包括性狀、鑒別、檢查，包括一般雜質(zhì)、有關(guān)物質(zhì)、殘留溶劑、晶型、粒度、溶液的澄清度與顏色、干燥失重和水分、異構(gòu)體，另外還有針對多肽藥物的特殊檢查項目如氨基酸比值、生物活性檢查、相關(guān)肽、反離子含量、肽圖分析、聚合物、降壓物質(zhì)檢查等項目，含量及效價測定。對于合成的多肽，其理化性質(zhì)除一般的常規(guī)項目外，還需要關(guān)注等電點、比旋度、緩沖液溶解性等。
多肽類藥物因其易被酶解、半衰期短、脂溶性差而多選擇注射途徑給藥，主要劑型為凍干粉針和注射液。對于一般的注射液和注射用凍干粉針，由于多肽類物質(zhì)不穩(wěn)定易被降解的特點，質(zhì)量控制的項目重點關(guān)注為有關(guān)物質(zhì)檢查項。合成多肽的有關(guān)物質(zhì)可以分為4類，主要為：
1)合成過程中帶入的工藝雜質(zhì)~缺失肽，斷裂肽，插入肽，未脫保護(hù)肽等肽類相關(guān)物質(zhì)；
2)降解雜質(zhì)~多肽脫酰胺，氧化，還原，水解，二硫鍵錯配，β-消除等不穩(wěn)定因素而產(chǎn)生的降解產(chǎn)物；
3)聚合物~二聚體及多聚體；
4)光學(xué)雜質(zhì)~消旋化，非對映異構(gòu)體雜質(zhì)。
多肽類藥物制劑主要是注射液和注射用粉針，在生產(chǎn)和儲存過程中更易發(fā)生降解變化，產(chǎn)生降解雜質(zhì)。而多肽藥物的檢測方法也主要有：反相高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳、高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、高效分子排阻色譜法。
參考文獻(xiàn)：
1. R Ismail，I Csóka.Novel strategies in the oral delivery of antidiabetic peptide drugs-insulin，GLP1 and its analogs[J]. European Journal of Pharmaceutics & Biopharmaceutics, 2017.
2. S Eskandari，T Guerin，I Tot，et al.Recent advances in self-assembled peptides: Implications for targeted drug delivery and vaccine engineering[J].Advanced Drug Delivery Reviews，2016.
3. S Shi，PKNguyen，HJ Cabral et al. Development of peptide inhibitors of HIV transmission[J].Bioactive Materials，2016，1 (2) :109-121
4. 曲朋，宋利，趙好冬，等.多肽合成研究進(jìn)展[J]. 中國現(xiàn)代中藥, 2015.
5. 田文靜，任雪，廖海明，等. 多肽類藥物質(zhì)量控制研究進(jìn)展[J].藥物分析雜志，2013.
6. 聶彩輝，徐寒梅. 多肽藥物的發(fā)展現(xiàn)狀[J]. 藥學(xué)進(jìn)展，2014.
7. 王克全，徐寒梅. 多肽類藥物的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)進(jìn)展，2015.
8. 部分?jǐn)?shù)據(jù)來源于湯森路透.
聯(lián)系客服
