文章來源：醫(yī)麥客
嵌合抗原受體T（CAR-T）細(xì)胞的概念最早于1989年提出，CART細(xì)胞結(jié)構(gòu)主要包括三部分，即：胞外區(qū)域、穿膜區(qū)域和胞內(nèi)區(qū)域。根據(jù)胞內(nèi)共刺激分子的不同，可以將CAR-T細(xì)胞分類為一代CAR-T細(xì)胞（不包括共刺激分子）、二代CAR-T細(xì)胞（包括一個共刺激分子）和三代CAR-T細(xì)胞（包括兩個共刺激分子）。CAR-T細(xì)胞在B細(xì)胞惡性腫瘤上取得良好的臨床治療效果，特別是復(fù)發(fā)難治的急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）。
目前CART細(xì)胞所針對的靶點在多數(shù)正常組織也有表達(dá)，如何找到特異性的靶點以及通過結(jié)構(gòu)的優(yōu)化，提高對腫瘤的殺傷效率，降低CAR-T細(xì)胞對正常組織的損害是CAR-T細(xì)胞面臨的一大挑戰(zhàn)。CAR-T細(xì)胞發(fā)揮免疫殺傷作用，依賴CAR-T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞相互接觸，并需克服腫瘤局部免疫抑制微環(huán)境。由于實體瘤往往伴隨有成纖維細(xì)胞包裹瘤體，在腫瘤微環(huán)境中存在大量的免疫抑制細(xì)胞、因子和調(diào)控分子，如何使CAR-T細(xì)胞遷移到腫瘤部位，克服腫瘤免疫抑制微環(huán)境，發(fā)揮CAR-T細(xì)胞殺傷作用則是將CAR-T細(xì)胞治療技術(shù)全面推向臨床應(yīng)用的另一大挑戰(zhàn)。進入患者體內(nèi)的CAR-T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞接觸，會在短時間內(nèi)大量擴增，導(dǎo)致免疫細(xì)胞的活化、擴增和細(xì)胞因子的大量釋放很可能導(dǎo)致致命性的細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）——發(fā)熱、昏迷、血壓降低，甚至多器官衰竭綜合征。雖然可以使用糖皮質(zhì)激素控制住CRS的副作用，但是糖皮質(zhì)激素的使用也會影響CAR-T細(xì)胞的增殖，從而影響療效。CAR-T細(xì)胞的副作用還需要通過優(yōu)化CAR-T細(xì)胞的結(jié)構(gòu)設(shè)計來從根本上消除。本文主要圍繞如何通過CAR-T細(xì)胞的結(jié)構(gòu)設(shè)計從而提高其有效性和安全性這兩部分進行分析與討論。
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增強CAR-T
細(xì)胞有效性的設(shè)計
1. 反轉(zhuǎn)免疫抑制信號的設(shè)計
針對前列腺癌細(xì)胞高表達(dá)免疫抑制分子PD-L1的特點，反轉(zhuǎn)抑制T細(xì)胞活性的抑制信號通路（PD1，PD-L1）為活化信號通路的設(shè)計——具體是在抗前列腺抗原PSAC的CAR-T基礎(chǔ)上，再對CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)染另外一段基因序列，使之胞外區(qū)和穿膜區(qū)是PD1分子，胞內(nèi)區(qū)是活化T細(xì)胞的CD28。高表達(dá)PD-L1的腫瘤細(xì)胞會對CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制作用，但是反轉(zhuǎn)免疫抑制信號的CAR-T細(xì)胞，將會克服PD1和PD-L1接觸后的免疫抑制作用，使免疫抑制信號變成活化信號，增強了CAR-T細(xì)胞對腫瘤的殺傷作用，同時還促進CAR-T細(xì)胞Th1類細(xì)胞因子（IL-2、IFN-γ、IL-12等）的分泌，在一定程度上改善了腫瘤局部免疫抑制的微環(huán)境。這樣的結(jié)構(gòu)也可以針對其他的免疫抑制信號（CTLA-4等）進行設(shè)計，詳見圖1A。
2. 可分泌PD-L1單抗的CAR-T細(xì)胞
在二代CAR-T的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上再加上一段能分泌PD-L1單抗的基因序列，使CAR-T細(xì)胞在與腫瘤細(xì)胞接觸過程中不僅能殺滅腫瘤細(xì)胞，并且局部分泌的PD-L1單抗與腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1結(jié)合，提高CAR-T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。有研究者針對羧基脫水酶Ⅸ（CAⅨ）這個靶點設(shè)計出能分泌PD-L1單抗的CAR-T細(xì)胞，PD-L1單抗和腫瘤細(xì)胞的結(jié)合不僅在一定程度上解除了免疫抑制——下調(diào)CAR-T細(xì)胞免疫抑制分子的表達(dá)（PD-1、TIM3、LAG3），同時還上調(diào)了NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）作用，增強CAR-T細(xì)胞殺傷腎癌細(xì)胞的效率。美國加州大學(xué)舊金山分校的研究人員構(gòu)建出能夠在體內(nèi)執(zhí)行一系列可定制反應(yīng)的免疫細(xì)胞，可以將藥物或者其他治療載體運送到腫瘤或其他不正常的組織中。這些被稱為SynNotchT細(xì)胞的免疫細(xì)胞可以高效地靶向腫瘤細(xì)胞，釋放一種特定的抗體藥物，將這套系統(tǒng)用到CAR-T細(xì)胞中，使得CAR-T細(xì)胞也可以分泌PD-L1單抗，從而改善免疫抑制的微環(huán)境，詳見圖1B。
3. 表達(dá)趨化因子的CAR-T細(xì)胞
抗GD2的CAR-T細(xì)胞治療成神經(jīng)細(xì)胞瘤，在此基礎(chǔ)上增加另外一段趨化因子CCR2b。由于成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞不僅表達(dá)腫瘤抗原GD2，而且還表達(dá)針對CCR2b的配體CCL2。因此，表達(dá)趨化因子的CAR-T細(xì)胞提高了CAR-T細(xì)胞對于腫瘤組織的遷移能力，使得CAR-T細(xì)胞和腫瘤充分接觸，提高了CAR-T細(xì)胞的療效。
4. 能自分泌IL-12的CAR-T細(xì)胞
IL-12屬于Th1類細(xì)胞因子，它可以提高免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性，但是全身使用IL-12會產(chǎn)生一些難以耐受的副作用和自身免疫疾病。構(gòu)建的CAR-T細(xì)胞表達(dá)能分泌IL-12，使得CAR-T細(xì)胞在被激活時可自分泌IL-12，在一定程度上可以改善免疫抑制微環(huán)境，而且還可以使CAR-T細(xì)胞周圍失活的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）受到IL-12的刺激被重新激活，從而增強免疫殺傷細(xì)胞其對腫瘤的殺傷作用。這種可以自分泌細(xì)胞因子并且刺激自身增殖的CAR-T細(xì)胞也稱為武裝的CAR-T細(xì)胞，詳見圖1C。
5. 雙靶點串聯(lián)的CAR-T細(xì)胞
盡管CAR-T019在治療復(fù)發(fā)難治的B細(xì)胞惡性腫瘤上取得了良好的療效，但是仍約有11%的患者在接受CART019的治療后，產(chǎn)生了CD19-腫瘤的復(fù)發(fā)，故全面徹底清除掉B細(xì)胞腫瘤就顯得極為重要。因此有研究者針對此設(shè)計了CD19和CD20（B細(xì)胞同時也高表達(dá)CD20）串聯(lián)表達(dá)于T細(xì)胞表面的CAR-T細(xì)胞，既可以提高CAR-T細(xì)胞對于B細(xì)胞惡性腫瘤的殺傷能力，又減少CD19-的B細(xì)胞腫瘤的復(fù)發(fā)率，詳見圖1D。
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提高CAR-T
細(xì)胞安全性的設(shè)計
由于CAR-T細(xì)胞所針對的靶點多數(shù)在正常細(xì)胞也表達(dá)，因此CAR-T細(xì)胞在攻擊腫瘤細(xì)胞的同時也會攻擊正常細(xì)胞?？笻er2靶點的CAR-T細(xì)胞在治療晚期結(jié)腸癌時患者就出現(xiàn)了致命性的急性呼吸衰竭綜合征，其因為表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面的Her2也表達(dá)于正常的肺上皮細(xì)胞，因此輸注的CAR-T細(xì)胞循環(huán)到肺時也產(chǎn)生了對肺上皮細(xì)胞的攻擊。如何優(yōu)化CAR-T細(xì)胞設(shè)計，使CAR-T細(xì)胞既可以特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞又能在體內(nèi)被系統(tǒng)性地控制，筆者總結(jié)了如何提高CAR-T細(xì)胞安全性的五種設(shè)計方法，其示意圖如圖2所示。
1. 安裝自殺基因
目前針對CAR-T細(xì)胞的自殺基因常見的設(shè)計設(shè)計有以下三種，分別是：（1）皰疹病毒中的胸苷激酶（ZVZ-TK）——ZVZ-TK可以使得更昔洛韋轉(zhuǎn)變成三磷酸更昔洛韋，從而誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞死亡；（2）Caspase-9可以被小分子化合物AP1903誘導(dǎo)二聚化，從而啟動CAR-T細(xì)胞的凋亡通路；（3）CAR-T細(xì)胞同時表達(dá)EFEα，當(dāng)出現(xiàn)不可控制的副作用時，給患者輸注針對EFEα的單抗，就會出現(xiàn)EFEα抗體誘導(dǎo)的ADCC效應(yīng)，使CAR-T細(xì)胞被清除。給CAR-T細(xì)胞安裝自殺基因的目的是通過清除CAR-T細(xì)胞來發(fā)揮作用的，這樣雖然控制了CAR-T細(xì)胞的副作用，但也清除掉CAR-T細(xì)胞。
2. 通過特異性抗體和CAR-T細(xì)胞的偶聯(lián)來控制
CAR-T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞結(jié)合通過特異性抗體［一端是抗腫瘤抗原的Fab端，另一端是PNE端］和CART細(xì)胞（CAR可與PNE端結(jié)合）結(jié)合的方法來控制CAR-T細(xì)胞的安全性。當(dāng)CAR-T細(xì)胞和這種特異性抗體同時給患者輸注時，CAR-T細(xì)胞就能通過特異性的抗體和腫瘤細(xì)胞結(jié)合，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的功能；當(dāng)腫瘤細(xì)胞被清除以后，只要不再輸注特異性的抗體，CAR-T細(xì)胞就不能再和腫瘤細(xì)胞結(jié)合發(fā)揮其對腫瘤細(xì)胞的特異性免疫殺傷作用（由于CAR-T細(xì)胞中CAR的設(shè)計并不直接針對腫瘤細(xì)胞），詳見圖2A。
3. 雙特異性的CAR-T細(xì)胞
上皮細(xì)胞腫瘤表達(dá)葉酸受體和間皮素受體，而正常細(xì)胞僅表達(dá)其中之一的抗原表位，設(shè)計將共刺激分子和CD3ζ鏈分別連接于不同腫瘤表位的雙特異性的CAR-T細(xì)胞。其設(shè)計的原理是將其針對抗原表位之一的CAR連接于胞內(nèi)段的共刺激分子，再將針對另外一抗原表位的CAR連接于CD3ζ鏈。當(dāng)腫瘤細(xì)胞和雙特異性CAR-T細(xì)胞結(jié)合后會激活共刺激分子和CD3ζ鏈，CAR-T細(xì)胞就會被激活去殺傷腫瘤細(xì)胞；而正常細(xì)胞只表達(dá)其中之一的抗原，那么只能活化共刺激分子或者CD3ζ，這樣就不能完全活化CAR-T細(xì)胞，因而CAR-T細(xì)胞并不能殺傷正常的組織細(xì)胞，詳見圖2B。
4. ICAR的設(shè)計
對于一些腫瘤細(xì)胞只特異性表達(dá)一種抗原表位，但是正常細(xì)胞表達(dá)這樣的抗原表位之外還表達(dá)另外一種抗原表位。因此就有研究人員利用這一特性設(shè)計出抑制嵌合抗原受體（ICAR）細(xì)胞，它有兩個scFv序列，其中之一是針對腫瘤細(xì)胞所設(shè)計的，其胞內(nèi)段是活化被修飾T細(xì)胞活性的活化序列；另外一段scFv序列是針對正常組織的，其胞內(nèi)段是抑細(xì)胞只表達(dá)活化被修飾T細(xì)胞的抗原表位，因此會激活I(lǐng)CAR細(xì)胞，從而殺傷腫瘤細(xì)胞；當(dāng)時當(dāng)ICAR細(xì)胞和正常細(xì)胞結(jié)合之后，就會產(chǎn)生抑制ICAR細(xì)胞活性的信號，因此ICAR細(xì)胞并不會被激活。通過這樣的設(shè)計可以有效地避免脫靶效應(yīng)，使得ICAR-T細(xì)胞只特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞，詳見圖2C。
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提高CAR-T細(xì)胞
有效性和安全性的其他措施
腫瘤細(xì)胞有一定的異質(zhì)性，而且腫瘤的發(fā)展也和腫瘤微環(huán)境是一個相互影響的過程，那么針對腫瘤的治療也需要是一個綜合立體化治療的過程。CAR-T細(xì)胞的設(shè)計往往是針對腫瘤細(xì)胞的殺傷，但是真正的腫瘤微環(huán)境可能存在很多對于CAR-T激活不利的因素，因此聯(lián)合可以改善免疫微環(huán)境的藥物改善免疫抑制微環(huán)境就顯得尤為重要。以下對研究熱門的免疫檢查點抑制藥物和CAR-T細(xì)胞的聯(lián)合使用，供者來源的T細(xì)胞制備CAR-T細(xì)胞，以及如何制備通用型的CAR-T細(xì)胞等問題進行討論。
1. CAR-T細(xì)胞和免疫檢查點抑制劑的聯(lián)合使用
CAR-T細(xì)胞和免疫檢查點抑制劑聯(lián)合使用可以減弱免疫抑制信號對于CAR-T細(xì)胞活性的抑制，有動物實驗表明，抗HER2+的CAR-T細(xì)胞和PD-1單抗聯(lián)合使用，其對腫瘤的殺傷作用強于單獨使用CAR-T細(xì)胞，PD-1單抗封閉了T細(xì)胞的PDL-1，阻止了PD-1和腫瘤的PD-1結(jié)合，從而增強了CAR-T細(xì)胞的殺傷能力。同時還有研究發(fā)現(xiàn)，將治療CLL的CD19CAR-T細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)藥物依魯替尼（ibrutinib）聯(lián)用可以下調(diào)T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞上PD-1的表達(dá)，從而提高了CD19 CAR-T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。
2. 供者來源CAR-T細(xì)胞的使用
對于移植后復(fù)發(fā)難治B細(xì)胞腫瘤可以采用供者來源的T細(xì)胞制備CAR-T細(xì)胞，對患者進行回輸，達(dá)到治愈的目的。因為很多復(fù)發(fā)難治的B細(xì)胞腫瘤患者本身由于巨大的腫瘤負(fù)荷導(dǎo)致體內(nèi)的免疫功能受損，其體內(nèi)的T細(xì)胞也受到損害?；颊咦陨淼腡細(xì)胞所制備CAR-T細(xì)胞難以有效擴增，細(xì)胞數(shù)也可能達(dá)不到入組條件的要求，從而影響療效。根據(jù)美國國家癌癥研究中心最近開展的臨床試驗表明：對于20例移植后復(fù)發(fā)的B細(xì)胞腫瘤患者，采用了供者來源的CAR-T細(xì)胞的治療，其中共有6例患者獲得了CR，2例患者獲得了PR；5例ALL患者有4例取得了CR，同時還有1例慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）患者取得了30個月長期緩解。
異體的T細(xì)胞輸注存在免疫排異的風(fēng)險，但是抗病毒（CMV、EBV）特異性T細(xì)胞由于其T細(xì)胞主要表達(dá)抗病毒的TCR，所以降低了免疫排異的風(fēng)險。因此用供者來源的抗病毒T細(xì)胞制備的CART細(xì)胞能避免免疫排異的風(fēng)險。同時由于抗病毒特異性CAR-T細(xì)胞可以通過TCR和CAR兩條信號通路刺激、活化、分泌細(xì)胞因子，因此其增殖優(yōu)于一般的異體來源T細(xì)胞所制備的CAR-T細(xì)胞。有研究者利用最新的CRASP/Cas9技術(shù)將CAR的這段基因定點插入到原來T細(xì)胞的TCR位置，這樣的設(shè)計避免了用逆轉(zhuǎn)錄病毒或者慢病毒隨機插入的缺陷——有可能導(dǎo)致插入突變而致癌，同時也在一定程度上消除了異體T細(xì)胞輸注到第三者的排異風(fēng)險。同時由于這樣制備的CAR-T細(xì)胞可以得到更加適當(dāng)?shù)拇碳?，所以其分化和擴增持續(xù)的時間要比傳統(tǒng)的CAR-T細(xì)胞時間更長。
3. 通用型CAR-T細(xì)胞的制備
CAR-T細(xì)胞給惡性腫瘤的治愈帶來了曙光，但穩(wěn)定可靠的療效，則依賴于規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)化的CAR-T細(xì)胞制備。由于每個患者的基本情況不一樣，所以很難獲得均一性良好的T細(xì)胞，因此統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞來源以及制備工藝，是獲得穩(wěn)定可靠的CAR-T細(xì)胞的根本前提。目前對于CAR-T細(xì)胞的制備工藝分為病毒轉(zhuǎn)染和非病毒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染CAR的操作目前可以規(guī)范化操作，但是如何使每個患者所使用的細(xì)胞達(dá)到較好的均一性，則是目前的一個難題。有研究者采用NK-92細(xì)胞系來制備CAR-NK細(xì)胞，這樣的方法可以獲得均一性較好的免疫細(xì)胞，但是CARNK細(xì)胞也存在轉(zhuǎn)染效率低以及在體內(nèi)不能持續(xù)擴增等問題；也有研究者采用第三方的免疫細(xì)胞，然后用基因編輯技術(shù)將其改造成可以輸注給患者使用的通用型CAR-T細(xì)胞（universalCAR-Tcells），但是其制備工藝相對復(fù)雜，安全性和有效性需要進一步的驗證。因此，如何用最簡單的工藝制備出安全有效的通用型CAR-T細(xì)胞還需進一步研究。
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結(jié)語
CAR-T細(xì)胞可以直接執(zhí)行特異性的腫瘤細(xì)胞殺傷，相比較其他免疫治療的方法，CAR-T細(xì)胞能更快和更加明確地清除腫瘤細(xì)胞，并且不受T細(xì)胞識別殺傷腫瘤細(xì)胞的MHC分子識別的限制。但是目前而言，CAR-T細(xì)胞能針對的腫瘤主要還血液腫瘤和一部分淋巴瘤；CAR-T細(xì)胞輸注到體內(nèi)，不受控制地進行擴增，產(chǎn)生了一系列不良反應(yīng)，最常見的為細(xì)胞因子釋放綜合征和脫靶效應(yīng)。筆者主要從CAR-T細(xì)胞的結(jié)構(gòu)設(shè)計上優(yōu)化CAR-T細(xì)胞的性能，總結(jié)了國內(nèi)外的研究進展，但是結(jié)構(gòu)的優(yōu)化只是CAR-T細(xì)胞設(shè)計中的其中一個視角。如何提高CAR-T細(xì)胞治療的有效性和安全性是一個可以從多角度進行探索的問題，如何設(shè)計出最優(yōu)的CAR-T細(xì)胞還需要細(xì)胞免疫治療的同仁們共同努力來取得新的突破。
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