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果蠅卵巢生殖干細(xì)胞（germline stem cell，簡稱GSC）是干細(xì)胞生物學(xué)研究的理想模型【1】，其增殖與分化受細(xì)胞內(nèi)在調(diào)控因子和微環(huán)境信號(hào)共同作用。許多參與調(diào)控GSC的內(nèi)源基因與哺乳動(dòng)物干細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因，在功能上具有很高的同源性。野生型果蠅卵巢是由32-40個(gè)卵巢小管構(gòu)成，每個(gè)卵巢小管的生殖腺前端僅有2-3個(gè)GSC。由于野生型果蠅卵巢GSC數(shù)量稀少，在單細(xì)胞水平分離、純化GSC，構(gòu)建生殖細(xì)胞圖譜和研究GSC細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄特征變得困難重重。

2023年8月21日，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院鐘國華教授團(tuán)隊(duì)在EMBO Reports上發(fā)表了題為Single-cell RNA sequencing identifies eggplant as a regulator of germ cell development in Drosophila的研究成果。

研究人員首先利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）對野生型果蠅卵巢進(jìn)行研究，分析得到24個(gè)不同細(xì)胞亞群的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜。結(jié)合marker基因表達(dá)模式和擬時(shí)序分析，進(jìn)一步對生殖細(xì)胞群進(jìn)行合并和篩選，最終獲得6類生殖細(xì)胞亞群：GSC、未分化生殖細(xì)胞群-1、未分化生殖細(xì)胞群-2、早期滋養(yǎng)細(xì)胞，卵細(xì)胞和末期滋養(yǎng)細(xì)胞。利用生信分析（SCENIC分析、GO/KEGG富集分析）和RNAi篩選，構(gòu)建GSC維持和分化的潛在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。隨后，作者利用原位雜交和免疫組化實(shí)驗(yàn)，鑒定出9個(gè)新GSC特異表達(dá)marker基因和1個(gè)合胞體（cyst）標(biāo)記基因。研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上，eggplant（eggpl）特異表達(dá)于早期未分化生殖細(xì)胞（GSC/CB）中, 并且主要在GSC中高表達(dá)。有趣的是，eggpl在幼蟲和成蟲階段的雌/雄蟲生殖腺前端也高表達(dá)。功能上，eggpl RNAi或純合突變引起的基因表達(dá)下調(diào)，會(huì)顯著增加2-cell，4-cell，8-cell cysts數(shù)量并加速這些細(xì)胞的細(xì)胞周期。eggpl表達(dá)下調(diào)能夠顯著促進(jìn)卵子形成，導(dǎo)致卵巢體積增大。這些結(jié)果表明，eggpl對調(diào)控早期生殖細(xì)胞分化具有重要意義。富含酵母的培養(yǎng)條件下，果蠅卵巢eggpl表達(dá)量顯著降低，cysts細(xì)胞的細(xì)胞周期速率顯著增加，卵巢體積也顯著增加（圖1）。因此，推測eggpl可能是一種參與營養(yǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的生殖細(xì)胞內(nèi)在信號(hào)分子。

（圖1）不同營養(yǎng)條件對eggpl表達(dá)量，cysts細(xì)胞周期和卵巢發(fā)育的影響

為了驗(yàn)證eggpl是否參與Insulin信號(hào)通路調(diào)節(jié)GSC增殖分化，研究人員利用Gal4/UAS系統(tǒng)特異驅(qū)動(dòng)Dp110CA或Dp110DN進(jìn)而調(diào)節(jié)PI3K（一種Insulin信號(hào)正調(diào)節(jié)因子）在生殖細(xì)胞的活性。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Dp110CA能夠顯著增加BrdU+ cysts細(xì)胞數(shù)，此結(jié)果與在富含酵母的培養(yǎng)條件下，果蠅卵巢cysts細(xì)胞表型一致。然而，過表達(dá)Dp110DN能夠顯著減少BrdU+ cysts細(xì)胞數(shù)。有趣的是，eggpl下調(diào)表達(dá)能夠抑制過表達(dá)Dp110DN引起的BrdU+ cysts減少。這些結(jié)果表明，eggpl可能是PI3K的下游調(diào)控因子。與此同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)，不論在富含酵母的培養(yǎng)條件下或標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，過表達(dá)Dp110DN均能顯著增加Eggpl的蛋白表達(dá)量，而過表達(dá)Dp110CA均能顯著減少Eggpl的蛋白表達(dá)量。綜上所述，eggpl作為Insulin信號(hào)通路的下游調(diào)控因子參與調(diào)控GSC增殖分化過程（圖2）。

（圖2）PI3K調(diào)節(jié)eggpl表達(dá)驗(yàn)證及eggpl調(diào)控GSC分化模式圖

本研究的意義：1.揭示了果蠅卵巢早期生殖細(xì)胞系在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的分化發(fā)育特點(diǎn)，分析獲得的GSC單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為生殖細(xì)胞生物學(xué)研究提供重要參考資源；2.首次報(bào)道eggpl的表達(dá)模式和eggpl突變卵巢表型特征，創(chuàng)新性提出eggpl可能作為Insulin通路下游靶標(biāo)因子參與調(diào)節(jié)GSC分化的新模式。

本論文工作主要由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院博士研究生孫智鵬（論文第一作者）完成，加州大學(xué)舊金山分校醫(yī)學(xué)院Todd. Nystul教授和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院鐘國華教授為論文共同通訊作者。

原文鏈接：https://doi.org/10.15252/embr.202256475