在組織培養(yǎng)過程中，離體細(xì)胞對(duì)任何毒性物質(zhì)都十分敏感。毒性物質(zhì)包括解體的微生物及細(xì)胞殘余物以及非營(yíng)養(yǎng)的化學(xué)物質(zhì)，因此對(duì)新采用和重新使用的培養(yǎng)皿等培養(yǎng)用品都要嚴(yán)格清洗和消毒。
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/strong>
學(xué)習(xí)并掌握細(xì)胞培養(yǎng)使用的器皿、器械的洗滌和消毒。
【儀器、材料及試劑】
1.儀器：超凈工作臺(tái)，干燥箱，高壓鍋，過濾器。
2.材料：紫外燈，0.22μm微孔濾膜。
3.試劑：75%酒精，0.1%新潔爾滅，高錳酸鉀，重鉻酸鉀，濃硫酸。
【操作步驟】
1.清洗
(1)玻璃器皿的清洗
步驟：按浸泡→刷洗→浸酸→沖洗等四步程序進(jìn)行。
①浸泡：新購進(jìn)的玻璃器皿常帶有灰塵，呈弱堿性，或帶有鉛、碑等有害物質(zhì)，故先用自來水浸泡過夜、水洗，然后再用2%~5%鹽酸浸泡過夜或煮沸30min，水洗。要領(lǐng)：培養(yǎng)用后的玻璃器皿要立即泡入清水中，使下道刷洗工作能順利進(jìn)行。用后的玻璃器皿常帶有大量的蛋白質(zhì)附著，干涸后不易刷洗掉，用后要立即用清水浸泡。
②刷洗：用軟毛刷、優(yōu)質(zhì)洗滌劑，刷去器皿上的雜質(zhì)，沖洗晾干。要領(lǐng)：浸泡后的玻璃器皿用毛刷沾洗滌劑去器皿上的雜質(zhì)、刷洗次太多，會(huì)損害器皿的表面光潔度，洗滌劑有使pH上升的趨勢(shì)，所以易選用軟毛刷和優(yōu)質(zhì)洗滌劑。禁止用去污粉。因其中含有砂粒。會(huì)嚴(yán)重破壞玻璃器皿的光潔度。特別注意刷洗瓶角部位。酸浸之前要把洗滌劑沖干凈。
③浸酸：將器皿浸泡于清潔液24h，如急用也不得少于4h。清潔液由重鉻酸鉀、濃硫酸及蒸餾水配制而成，具有很強(qiáng)的氧化作用，去污能力很強(qiáng)。經(jīng)清潔液浸泡后，玻璃器皿殘留的末刷洗掉的微量雜質(zhì)可被完全清除。
④沖洗：先用自來水充分沖洗，吸管等沖流10min，瓶皿需每瓶灌滿、倒掉，反復(fù)10次以上。然后再經(jīng)蒸餾水漂洗3次,不留死角。晾干或烘干備用。對(duì)已用過的器皿，凡污染者必先經(jīng)煮沸30min或放3%鹽酸中浸泡過夜，未污染者可不需滅菌處理，但仍要刷洗、清潔液浸酸過夜，沖洗等。
【附】清潔液的配制和使用注意事項(xiàng)
1.清潔液(配方見表2-1)
配方成分
弱酸
次強(qiáng)液
強(qiáng)液
重鉻酸鉀(g)
清水(ml)
濃硫酸(ml)
硫酸濃度(v/v)
50
1000
90
8%
100
1000
160
14%
60
200
800
80%
①選用耐酸塑料桶或不銹鋼桶配制為宜。
②先將重鉻酸鉀溶于水(用玻璃棒攪拌助溶，有時(shí)不能完全溶解)。
③緩緩加入濃硫酸，切忌過急，否則將產(chǎn)熱而發(fā)生危險(xiǎn)(絕不可將重錯(cuò)酸餌液倒入濃硫酸中)。
④清潔液配好呈棕紅色，待變綠色時(shí)表明失效。
由于清潔液的腐蝕性極強(qiáng)，配制與應(yīng)用時(shí)必須小心，并做好防護(hù)。
2.矽酸鈉洗液
貯存液(×100)
砂酸納80克加偏磷酸鈉9克加熱溶在1000ml水中。使用時(shí)用水稀釋100倍，將器皿放入煮沸20min，冷卻后沖洗，再用2%HCl浸泡2h后，自來水沖洗。矽酸鈉洗液較清潔液安全，但價(jià)格較貴。
(2)塑料器皿清洗
自來水充分浸泡→沖洗→2%Na0H浸泡過夜→自來水沖洗→2%~5%鹽酸浸泡30min→自來水沖洗→蒸餾水漂洗3次 →晾干→紫外線照射30min(或先用75%酒精浸泡、擦拭，再用紫外線照射30min)。凡能耐熱的塑料器皿，最好經(jīng)101.3kPa(121.3℃)高壓滅菌。
(3)膠塞等橡膠類處理
新購置者先經(jīng)自來水沖洗→2%NaOH煮沸15min→ 自來水沖洗→2%~5%HCl煮沸15min→ 自來水沖洗5次以上→蒸餾水沖洗5次以上→ 蒸餾水煮沸10min，倒掉沸水讓余熱烘干瓶塞等。或蒸餾水沖洗晾干，整齊擺放于小型金屬盒內(nèi)經(jīng)101.3kPa高壓滅菌。
(4)金屬器械的清洗
新購進(jìn)的金屬器械常涂有防銹油，先用沾有汽油的紗布擦去油脂，再用水洗凈，最后用酒精棉球擦拭，晾干。用過的金屬器械應(yīng)先以清水煮沸消毒，再擦拭干凈。使用前以蒸餾水煮沸10min，或包裝好以101.3kPa高壓15min。
(5)除菌濾器的處理
用過的濾器將濾膜去除，用三蒸水充分洗凈殘余液體，置干燥箱中烘干備用。
2.包裝
包裝的目的是防止消毒滅菌后再次遭受污染，所以經(jīng)清洗烤干或晾干的器材，應(yīng)嚴(yán)格包裝后再行消毒滅菌處理。包裝材料常用包裝紙、牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、玻璃或金屬制吸管筒、紙繩等。包裝分為局部包裝和全包裝兩類，前者用于較大瓶皿，一般用硫酸紙和牛皮紙將瓶口包扎好;后者適于較小培養(yǎng)瓶皿、吸管、注射器、金屬器械和膠塞等，以下為常用瓶皿、吸管、無菌衣帽等的包裝方法，其它物品可參照處理。
①瓶類：硫酸紙罩以瓶口,外罩二層牛皮紙用繩扎緊。
②小瓶皿、膠塞、刀剪等器械可裝人飯盒，飯盒再以牛皮紙包好，繩扎好。
③吸管、滴管口用脫脂棉塞上(不要太緊或太松)裝人消毒筒內(nèi)，濾器、濾瓶、橡皮管等都要用牛皮紙包好瓶口等，外罩一層牛皮紙包好，再用包布包好。
④無菌衣、帽、口罩，均以牛皮紙或包布包好，繩扎好。
3.消毒滅菌
嚴(yán)格的消毒滅菌對(duì)保證細(xì)胞培養(yǎng)的成功是極為重要的，其方法分為物理法和化學(xué)法兩類。前者包括干熱、濕熱、濾過、紫外線及射線等，后者主要指使用化學(xué)消毒劑等。
①熱滅菌：玻璃器皿，160~170℃，90~120min或180℃45~60min。
②蒸氣滅菌：用于玻璃器皿、濾器橡膠塞、解剖用具、耐熱塑料器具、受熱不變性的溶液等，不同物品其有效滅菌壓力和時(shí)間不同，如培養(yǎng)用液、橡膠制品、塑料器皿等用68kPa(115℃)高壓滅菌10min;布類、玻璃制品、金屬器械等用103kPa(121.3℃)高壓滅菌15~20min。
③濾過除菌：適于含有不耐熱成分的培養(yǎng)基和試劑的除菌，用孔徑為0.22μm微孔濾膜可除去細(xì)菌和霉菌等，用此濾膜過濾兩次，可使支原體達(dá)到某種程度的去除，但不能除去病毒。
④紫外線：紫外線的波長(zhǎng)為200~300nm，最強(qiáng)是在254 nm，6~15平方米最少一只紫外燈，高度要在2.5m以下，濕度45%~60%，桿菌效果好，球菌次之，霉菌、酵母菌最差，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)不低于30分鐘的照射時(shí)間。
⑤熏蒸消毒：當(dāng)遇有細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)多次污染，或?qū)嶒?yàn)室兩個(gè)月一次的常規(guī)消毒，均可用高錳酸鉀5~7.5g，加甲醛(40%)10~15ml，混合放入一開放容器內(nèi)，立即可見白色甲醛煙霧，消毒房間需封閉24小時(shí)，致少4小時(shí)以上。
⑥煮沸消毒：緊密情況時(shí)使用，金屬器械和膠蹇在水中煮20~30分鐘，趁熱傾去水分即可使用。
⑦化學(xué)消毒：化學(xué)藥品消毒滅菌法是應(yīng)用能殺死微生物的化學(xué)制進(jìn)行消毒滅菌的方法。實(shí)驗(yàn)室桌面、用具及洗手用的溶液均常用化學(xué)藥品進(jìn)行消毒殺菌。常用的有：2%煤酚皂溶液(來蘇爾)、0.25%新潔爾滅、1%升汞、3~5%甲醛溶液、75%酒精。
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