創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是常見(jiàn)的腦外科疾病，由于直接或間接暴力作用于頭部，損傷腦實(shí)質(zhì)，引起暫時(shí)或永久性的意識(shí)喪失、記憶缺失、認(rèn)知及神經(jīng)功能障礙等，致殘率和死亡率極高。根據(jù)病理性質(zhì)可將TBI分為原發(fā)性和繼發(fā)性，由于直接沖擊造成的原發(fā)性顱腦損傷難以逆轉(zhuǎn)，但是繼發(fā)的一系列神經(jīng)炎性反應(yīng)及神經(jīng)功能缺失所引起的偏癱、智力減退等通過(guò)治療可以得到緩解。
臨床上電針治療TBI療效確切[1]，但在發(fā)生TBI后何時(shí)介入電針治療效果最佳及其具體治療機(jī)制尚不明確。
AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是廣泛存在于細(xì)胞中的一條重要信號(hào)通路，在細(xì)胞代謝和應(yīng)激中起關(guān)鍵作用，通過(guò)影響其下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)控自噬、抑制凋亡[2]。此研究擬初步明確電針對(duì)TBI的早期治療效應(yīng)，從自噬的角度，觀察電針對(duì)TBI大鼠AMPK/mTOR通路自噬相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用，探討電針促進(jìn)TBI康復(fù)的作用機(jī)制。
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組
SPF級(jí)健康6周齡雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g。適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針Ⅰ組、電針Ⅱ組，10只/組。
2.TBI模型制備
2％戊巴比妥鈉(0.2mL/100g)腹腔注射麻醉大鼠，參照Feeney的自由落體方法加以改良制備大鼠左側(cè)TBI模型。固定大鼠于腦立體定位儀，沿正中線左側(cè)旁開(kāi)5mm處開(kāi)一長(zhǎng)約1.5cm的縱向切口，用電磨機(jī)于冠狀縫后6mm、矢狀縫左側(cè)旁開(kāi)4mm處鉆出一直徑5mm的小孔，用20g砝碼由35cm高度的透明玻璃管中垂直下落打擊小孔，造成左腦頂葉中度損傷。縫合皮膚后單籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組僅鉆開(kāi)頭骨，無(wú)打擊。術(shù)后連續(xù)7d腹腔注射慶大霉素(0.5mg/100g)注射液抗感染治療。
3.干預(yù)方法
“水溝”(直刺1mm)，點(diǎn)刺20s后出針
“百會(huì)”(向前斜刺2mm)，留針10min
患側(cè)“內(nèi)關(guān)”(直刺1mm)，“足三里”(直刺7mm)；此二穴接電針儀，強(qiáng)度以動(dòng)物肢體輕微抖動(dòng)為宜，約1mA，斷續(xù)波，頻率2Hz，留針10min，1次/d。
于建模后第7天開(kāi)始對(duì)電針Ⅰ組大鼠進(jìn)行電針干預(yù)，連續(xù)7d；于建模后24h開(kāi)始對(duì)電針Ⅱ組大鼠行電針干預(yù)，連續(xù)14d。
4.觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法
HE染色觀察大鼠損傷區(qū)腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化
尼氏染色觀察大鼠損傷區(qū)腦組織神經(jīng)元變化
Western blot法檢測(cè)AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、Ulk1、p-Ulk1表達(dá)
1.各組大鼠損傷區(qū)腦組織皮層病理形態(tài)的比較
假手術(shù)組神經(jīng)元分布均勻、排列整齊、形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，胞核多為圓形藍(lán)染，胞質(zhì)為粉紅淡染，無(wú)壞死、滲出。
模型組可見(jiàn)細(xì)胞核固縮、破碎等，空泡明顯，出現(xiàn)壞死區(qū)域，可見(jiàn)瘢痕組織。
電針Ⅰ組、電針Ⅱ組受損腦組織空泡樣改變與瘢痕較模型組明顯減少，電針Ⅱ組恢復(fù)情況優(yōu)于電針Ⅰ組。見(jiàn)圖1。
尼氏染色顯示
假手術(shù)組的尼氏小體分布均勻，呈斑片、虎斑或顆粒狀。
模型組損傷區(qū)尼氏小體的數(shù)量明顯減少。
電針Ⅰ組、電針Ⅱ組尼氏小體缺失數(shù)量均較模型組減少。見(jiàn)圖2。
2.各組大鼠損傷區(qū)腦組織皮層中AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、Ulk1、p-Ulk1蛋白表達(dá)的比較
與假手術(shù)組比較
模型組大鼠損傷區(qū)腦組織皮層中p-AMPK/AMPK顯著升高(P＜0.01)，p-mTOR/mTOR、p-Ulk1/Ulk1均顯著降低(P＜0.01)。
與模型組比較
兩電針組p-AMPK/AMPK顯著降低(P＜0.01)，p-mTOR/mTOR、p-Ulk1/Ulk1顯著升高(P＜0.01)。
與電針Ⅰ組比較
電針Ⅱ組p-AMPK/AMPK明顯降低(P＜0.05)，p-mTOR/mTOR、p-Ulk1/Ulk1明顯升高(P＜0.05)。見(jiàn)圖3。
電針在治療TBI等神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面效果較好[3-6]，并引起醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。相關(guān)研究[4,7]表明“足三里”“百會(huì)”“內(nèi)關(guān)”“水溝”是治療TBI的優(yōu)選腧穴。百會(huì)位居巔頂，屬督脈，有“三陽(yáng)五會(huì)”之稱，可醒腦安神、振奮陽(yáng)氣、升清化濁。水溝亦屬督脈，為醒腦蘇厥之要穴。內(nèi)關(guān)屬八脈交會(huì)穴，亦是手厥陰心包經(jīng)之絡(luò)穴，“絡(luò)心系”，故可調(diào)神定志。足三里為足陽(yáng)明胃經(jīng)之合穴，可“療五勞羸瘦，七傷虛乏”，又有“治痿獨(dú)取陽(yáng)明”之說(shuō)，可濡潤(rùn)宗筋，乃強(qiáng)壯人體之必取穴。諸穴合用，可醒腦開(kāi)竅、調(diào)和陰陽(yáng)、通經(jīng)活絡(luò)、補(bǔ)益氣血，促進(jìn)TBI的康復(fù)。
自噬與凋亡是顱腦損傷后神經(jīng)元的重要生理病理變化基礎(chǔ)[8-9]，由于刺激的程度和刺激時(shí)間的不同，凋亡和自噬的強(qiáng)弱有所差別。但隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，自噬被過(guò)度激活，導(dǎo)致細(xì)胞受損，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡，并最終通過(guò)凋亡依賴途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[10]。
AMPK/mTOR信號(hào)通路在調(diào)控自噬中起著樞紐的作用[11]?；罨腁MPK可通過(guò)磷酸化結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合體(TSC2)激活TSC1/2，進(jìn)而抑制小GTP酶Rheb，負(fù)向調(diào)控mTOR功能，抑制mTOR磷酸化，促進(jìn)自噬的發(fā)生[12]。此外，AMPK也可以通過(guò)磷酸化聯(lián)接蛋白raptor，阻礙raptor與mTOR或mTOR與底物的結(jié)合，同樣抑制mTOR的活化[13]。
本研究顯示，與假手術(shù)組比較，模型組p-AMPK蛋白表達(dá)水平上調(diào)，p-mTOR的表達(dá)下調(diào)，表明顱腦外傷后AMPK被激活，自噬活性增強(qiáng)，且AMPK與mTOR在自噬的調(diào)節(jié)中相互協(xié)調(diào)制約。其中p-Ulk1的表達(dá)趨勢(shì)與p-mTOR相似，表明TBI發(fā)生后p-AMPK抑制了mTOR的活化，同時(shí)也抑制了mTOR與Ulk1的相互作用，促進(jìn)了自噬的發(fā)生。電針干預(yù)能夠顯著下調(diào)p-AMPK相對(duì)表達(dá)水平，上調(diào)p-mTOR、p-Ulk1相對(duì)表達(dá)水平，提示電針可能是通過(guò)抑制AMPK的磷酸化，促進(jìn)mTOR與Ulk1的活化，進(jìn)而抑制神經(jīng)元發(fā)生過(guò)度的自噬，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。電針Ⅱ組大鼠腦組織損傷改善情況明顯優(yōu)于電針Ⅰ組，此結(jié)果與課題組前期研究結(jié)果一致，同時(shí)與電針Ⅰ組相比，電針Ⅱ組腦組織中p-AMPK/AMPK明顯降低，而p-mTOR/mTOR、p-Ulk1/Ulk1均升高，表明電針早期介入治療對(duì)神經(jīng)元自噬的調(diào)控作用更明顯。
綜上所述，電針可能是通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK，mTOR和Ulk1等自噬相關(guān)蛋白的活化狀態(tài)來(lái)抑制腦神經(jīng)元自噬的過(guò)度活化，從而發(fā)揮對(duì)TBI的神經(jīng)保護(hù)作用。
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