[目的]觀察中藥細辛、威靈仙、北豆根水煎劑不同劑量對大鼠腎臟損傷作用的生化學改變特點及病理組織形態(tài)學改變特點。
[方法]中藥細辛、威靈仙、北豆根水煎劑分別以低、中、高三個劑量給大鼠灌胃，每日一次，共三個月。期間觀察各組大鼠體重增長情況，尿中蛋白、尿糖及尿潛血變化情況，腎功能指標及組織形態(tài)學改變情況。
[結果]細辛、威靈仙、北豆根水煎劑低、中、高劑量組的尿糖、尿潛血及血肌酐、尿素氮的值在三個月內均有所波動，但與正常對照組相比無統(tǒng)計學意義。細辛高劑量組三個月的尿蛋白定性變化與對照組相比都有顯著差異。威靈仙低、中、高劑量組三個月的尿蛋白變化與對照組相比均無統(tǒng)計學意義。北豆根高劑量組三個月尿蛋白變化與對照組相比有顯著差異。細辛、威靈仙及北豆根中、高劑量組的腎臟組織形態(tài)學觀察均可見不同程度的腎小管及腎間質損傷。
[結論]藥典法定劑量下單用細辛、威靈仙、北豆根水煎劑對大鼠腎臟無明顯損害，但長期大劑量單用細辛、威靈仙、北豆根水煎劑則可引起腎臟組織形態(tài)及腎功能的改變。
前 言
自1993 年比利時學者Vanherweghem等提出了“中草藥腎病”( Chinese Herbs Nephropathy,CHN)的概念后1,23),關于含有馬兜鈴酸的中草藥引起腎損害的問題已經引起了國內外學者的廣泛關注4]。美國食品和藥品管理局(FDA) 2000年5月16日，發(fā)布了“FDA對產業(yè)界的有關含有馬兜鈴酸植物藥物和食品的通告”。隨后，在2000年5月31日發(fā)布了“FDA對衛(wèi)生行業(yè)的有關含有馬兜鈴酸植物藥物和食品的通告”，并附有相關藥物的目錄D]。通告將含有馬兜鈴酸的藥物歸為三類，A類植物包括那些源自馬兜鈴科植物，既往的研究肯定含有馬兜鈴酸成分，且馬兜鈴酸成分為某些藥物的主要活性成分。而B類植物往往因為中藥藥名相似，其可能摻雜有相應的A類植物，事實上不一-定含有馬兜鈴酸成分，或者它們?yōu)轳R兜鈴科植物，但現(xiàn)有的資料卻并沒有其含有馬兜鈴酸的記載。2000年6月9日，F(xiàn)DA在“至今未收到類似不利事件報告”的情況下，命令停止進口、制造和銷售已知含有和“懷疑含有馬兜鈴酸的原料和成品”[06。我們在其提到的B類所謂“可能混雜有馬兜鈴酸的植物藥物”中選出了幾味臨床常用的中藥(包括細辛、威靈仙、北豆根)作為研究對象，利用腎功生化檢測、組織形態(tài)學檢查手段，觀察每味中草藥水煎劑不同劑量、不同服用周期，對大鼠腎臟損傷作用的生化學變化特點及病理形態(tài)學改變特點。
第一部分
綜 述：
21世紀是知識經濟時代,中醫(yī)藥學以其獨有的深厚文化內涵和公認的特色優(yōu)勢，彌補著現(xiàn)代醫(yī)學高度發(fā)展中所發(fā)現(xiàn)的自身體系的欠缺和局限，國內外相關領域開始審視傳統(tǒng)中醫(yī)藥學重要而巨大的潛在價值，并正對它重新認識和評價。這種舉足輕重的影響，不僅來自人類對東方文明的好奇和自然回歸的愿望，更直接地來自于科學發(fā)展和醫(yī)學進步的本身。然而近年來，隨著世界范圍內回歸自然的潮流，人們對植物藥物的需求量大幅度增加，中藥不良反應越來越為人們所重視，有關中藥不良反應的報道也越來越多，誤用中草藥而引起的腎損害，正漸漸成為國內外醫(yī)學界關注的“熱點”。一、“中草藥腎病”的提出
1993年，比利時學者Vanherweghem首先發(fā)現(xiàn)9名婦女接受含有中草藥成分的減肥食療后，出現(xiàn)快速進展的間質纖維化腎炎，其中有2例初診即被發(fā)現(xiàn)為終末期腎衰，立即進行了透析。由于這些患者都有長期服用中草藥的歷史，而被發(fā)現(xiàn)上述病例的減肥診所開業(yè)15年從未出現(xiàn)過類似問題，只是從1990年伊起他們在減肥處方中加入了含有馬兜鈴酸的中藥廣防己(Aristolochia fangchi)， 而非原方所要求的防己科植物漢防己( Stephania terandra) ，腎功能損傷的問題才逐漸被發(fā)現(xiàn)，由此直接導致了“中草藥腎病”(CHN)概念的提出。這一事件在國內外引起了強烈反響，國內專家難以接受“中草藥腎病”的提法，外國人更對天然藥、中草藥的安全性提出了置疑。-些研究發(fā)現(xiàn)，不少國家均有傳統(tǒng)草藥引起不良反映的報告，包括草藥引起的腎病，因此國外有專家建議將CHN改稱為“草藥腎病”，甚至有人提出“比利時腎病”的名稱。另一些文獻報告顯示，這些中草藥的主要毒性成分是馬兜鈴酸( AristolochicAcid, AA)，多數(shù)學者認為AA是導致CHN的主要物質，故匡 內一些學者建議將CHN改稱為“馬兜鈴酸腎病”(AristolochicAcid Nephropathy, AAN)”。
著名腎臟病專家王海燕教授曾指出:如果中草藥引起的腎損害稱為“中草藥腎病”，那么像青霉素等西藥引起的腎損害是否也可以稱為“西藥腎病”呢?她認為比利時患者的腎損害可能與三個因素有關: (1)用錯藥，誤將廣防己替代漢防己; (2)用量過大，超過藥典規(guī)定的劑量;(3)中草藥與同時使用的其他西藥相互作用，不能排除這些西藥的副作用。就在王海燕教授發(fā)表上述觀點之前，日本金澤大學癌癥研究所的元雄良治和日本京都大學的小野孝彥等也已經分別在日本權威雜志《日本內科學會雜志》[8]、《日本東洋醫(yī)學雜志》 [9]上發(fā)表了類似的觀點。他們明確指出:所謂的“中草藥腎病”應該更名為“馬兜鈴酸腎病”。其實，連當初提出“中草藥腎病”之名的比利時人Vanherwegherm也已認識到針對全部中藥而說的“中草藥腎病”是片面的，而應當改為“馬兜鈴酸腎病”，這一觀點也發(fā)表在他當初提出“中草藥腎病”的國際權威雜志《柳葉刀》上。
雖然這些名詞的提出是對事件的研究和探討，是認識由淺入深的必然過程，但不可否認“中草藥腎病”這一概念的提出，已經對中醫(yī)藥的臨床應用和未來發(fā)展帶來了巨大的副面影響，如對此不加以深入研究，將來勢必影響到整個中醫(yī)藥事業(yè)的弘揚與振興。
二、國內外研究概況
其實，對于中藥毒性的研究在幾十年前就有專家報道過。國內學者吳松寒[10]、洪用森早在1964年就首次報告了2例病人因服用大劑量木通而導致急性了腎功能衰竭。1964年，Jackson等人在用馬兜鈴酸進行癌癥化療1期臨床試驗時發(fā)現(xiàn)它可導致急性腎小球壞死。1977年，美國FDA宣布停止使用碎杏仁制成的VB17 (laetrile) ，因為其主要成分苦杏仁苷水解時產.生氰化氫，口服會導致中毒和死亡(12]。 1979年，新加坡政府禁止進口和銷售含有小檗堿的制劑，并報道其與葡萄糖一6一磷酸脫氫酶水平低下的嬰兒黃疸和貧血有關。1980年，一種由傳統(tǒng)草藥當歸、川芎、丹參、五靈脂、紅花等制成的膠囊，由于可能與先天畸形有關，在印度尼西亞被迫停止銷售。1981年，前聯(lián)邦德國衛(wèi)生署禁止銷售含有馬兜鈴酸的專利藥品和含馬兜鈴科植物的中藥制劑[13]。1982年，Goggelmann等人報道了馬兜鈴酸的誘變性。1983年，Mengs等人報道了馬兜鈴酸的致癌性。1990年，Schmeiser等人報道了馬兜鈴酸代謝物馬兜鈴內酰胺通過與脫氧腺苷殘基結合可以激活大鼠腫瘤細胞中的原癌基因--ras基因。1992年，前聯(lián)邦德國衛(wèi)生署取消了所有歐茜草制劑，包括蒽醌及其術生物，并宣布后者可能在有潰瘍的胃部、腸粘膜和肝臟誘導腫瘤的形成[13)。1993年，日本學者報告了1位女性病人因減肥而長期服用含有漢防已堿、黃芪、蒼術、大棗、甘草和生姜等中成藥而引起獲得性Fanconi綜合征的病例(14]。1995~ 1998年， 臺灣不同地區(qū)先后發(fā)生了12例快速進展的纖維間質性腎病，7例做了血液透析，其余均出現(xiàn)了進展性腎病，1例引起膀胱癌[15]。1996年，Schmeiser等 人[161報道了馬兜鈴內酰胺與腎組織DNA的主要加和物7-(deoxyadenosine-N6-y1) -aristolactma I的分離、檢測，從而進一步證明了馬兜鈴酸與ras基因的關系，并將馬兜鈴酸劃歸為基因毒性致癌物。同年,法國Nice地區(qū)發(fā)現(xiàn)2例終末期腎衰病例有廣防已服藥史，該地區(qū)藥物不良反應監(jiān)測中心考慮其中1例可能與廣防已有關，但另1例不能確定。1997年，日本媒體報道了中國天津制造的當歸四逆加吳茱萸生姜湯顆粒劑(代號KM-38，每10.5g約含關木通1g)腎毒害事件117)。1999年，Cosyns等人報道了馬兜鈴內酰胺激活與癌相關的p53基因[18]。同年，英國學者在《刺血針》雜志報告了2例患者因長期服用含關木通的草藥茶治療濕疹而出現(xiàn)的晚期腎衰竭事件[19]。英國藥物安全委員會(CSM)建議，應立即禁止使用含有馬兜鈴的中草藥，同時英國醫(yī)藥管理局(MCA)也提供了一項關于禁止可能含有馬兜鈴的中草藥在英國進口、銷售和供應的禁令并進行表決，其結果是自1999年7月至10月對馬兜鈴在全英范圍內進行暫時性禁用。然而不久，MCA就將其延續(xù)為對含馬兜鈴的中草藥產品實行無限期禁用[201。2000年，由比利時Libre大學Erasme醫(yī)院Nortier等1[111人組成的研究小組，經過對39名因服廣防己減肥丸導致腎功能衰竭病人的腎組織和輸尿管組織檢查及DNA加和物的分離與定量檢測，證實了馬兜鈴酸、廣防己和關木通的基因致癌毒性。2000年6月8日，美國最權威的臨床醫(yī)學雜志一一《新英格蘭醫(yī)學雜志》發(fā)表了比利時醫(yī)學研究者Nortier等人撰寫的“泌尿系統(tǒng)癌癥與服用廣防己有關”的研究報告1211。文中提出:自比利時的這家減肥診所誤用上述中草藥以來，迄今確診的CHN患者已有105例，其中43例發(fā)生腎功能衰竭(31例做了腎移植，12例正在進行血液透析并等待腎移植)，至少發(fā)現(xiàn)了18份病例患尿道上皮癌。這種病的臨床特點表現(xiàn)，為: (1)在1~2年內發(fā)展為終末期腎病: (2)組織學顯示具有明顯廣泛的間質性纖維化; (3)尿道上皮異型、惡變及低分子量蛋白尿; (4)與其他間質性腎病相比，這些病例的貧血更重、腎功能衰竭發(fā)展速度更快[221。一旦發(fā)展為終末期腎功能衰竭，即使停用這種草藥，也很難恢復23。當時導致包括馬兜鈴、木通、青木香等數(shù)十種含馬兜鈴酸的中草藥和相關中成藥如八正丸、龍膽瀉肝丸、冠心蘇合丸等在美國應用受阻。2000年7月，美國媒體大肆渲染英國和比利時發(fā)生的上述事件，F(xiàn)DA立即下令禁止馬兜鈴屬草藥的進口，并決定收回市場上銷售的含有馬兜鈴酸的中成藥。隨后法國、加拿大、德國、西班牙等10多個國家紛紛作出相應禁令。2001年1月17日，馬來西亞全面禁止銷售含有馬兜鈴酸的中藥，并立即取消龍膽解毒片、百咳靈片、氣管炎咳喘片等17種含有該成分中成藥的注冊，限定所有的醫(yī)院和銷售公司立即停止銷售并收回成藥。香港和新加坡也發(fā)出禁令，迫使含有馬兜鈴酸的中藥退出市場。2001年6月20日，F(xiàn)DA又要求消費者停止服用并回收含有馬兜鈴酸的八珍湯、當歸四逆湯、導赤散、甘露消毒丹、龍膽瀉肝湯等13種中國中草藥制劑。
李愛群等對17年來中草藥導致腎損害的臨床分析結果表明，27種中草藥、5種中成藥引起252例腎損害(A型反應239例，B型反應13例)，死亡80例占31.75%，主要為急性腎衰和各種腎炎。經研究證實，所用湯方中均為木通素(即馬兜鈴酸)所致(24。近年在個案報道的基礎上，鐘百靈等125]報道治療了23例CHN腎功能衰竭早期者，患者均有服用龍膽瀉肝丸或含關木通的中藥煎劑病史。1999年，裘奇等學者在國內首次建立了關木通中馬兜鈴酸所致大鼠急性腎損傷的動物模型，并觀察了中毒時大鼠腎功能指標的變化(26]。陶雅非等[27]觀察33例以慢性腎功能衰竭為主要表現(xiàn)的馬兜鈴酸腎病患者，均有服龍膽瀉肝丸或含關木通、廣防己的中藥煎劑病史,就診時氮質血癥期18例;衰竭期8例;尿毒癥期7例。觀察8個月后，2l例進入尿毒癥期:7例進入衰竭期: 5例為氮質血癥期。黎磊石，楊麗珍、葉任高，宋立群等專家分別發(fā)表了《由木通腎毒性帶來的思考一一提高對中草藥腎毒性的認識》(281、《中 草藥引起腎損害的現(xiàn)狀及防治》(291、《中草藥腎損害的研究與展望》。2000年,崔太根、王海燕等發(fā)表了《藥典法定劑量關木通對大鼠腎功能及間質結構影響的研究》，證實藥典規(guī)定用量的關木通并不會引起大鼠腎間質纖維化病變[301。2001年，馬紅梅等人的實驗研究證實了關木通主要毒性成分馬兜鈴酸及其鼠血清對體外細胞模型的毒性影響，并進--步采用高效液相色譜法檢測馬兜鈴酸鼠血清中馬兜鈴酸及其代謝產物的含量(11。此后，關于中草藥毒性的綜述性文章屢見不鮮，中藥引起腎臟損害的問題成為了國內外專家關注的熱點。
上述有關中草藥引起腎臟病變的文獻報道，盡管存在使用中草藥種類、配方、劑量、服用方法、治療對象等不同，但腎損害的臨床表現(xiàn)及動物實驗結果均表明中草藥導致的腎臟變是存在的。
三、祖國醫(yī)學對中藥毒性的認識
中藥是祖國醫(yī)學的一大寶庫，幾千年來，它廣泛運用于臨床，在疾病的預防和治療方面發(fā)揮了重要的作用。我們的祖先在數(shù)千年與疾病斗爭的過程中，提出十八反、十九畏，妊娠禁忌藥的明訓，逐步認識到一些藥物是有毒的。在上古時已有“神農嘗百草，一日遇七十毒”的記述?！渡褶r本草經》 中提到藥物有酸、咸、甘、苦、辛五味，又有寒、熱、溫、涼四氣及有毒無毒之分。它共收錄了365種中藥，分為上、中、下三品。上品120種，無毒，主養(yǎng)命，可久服;中品120種，無毒或有輕微毒，主養(yǎng)性，多為補養(yǎng)兼有攻治疾病之效;下品125種，多有毒，不可久服，多為除寒熱、破積聚的藥物，主治病。這是中藥毒性在現(xiàn)存本草文獻中的最早記載。但真正在某些具體藥物條目下記載毒性的則首見于《吳普本草》。此后，在歷代本草的藥物條目下，大多都有有毒或無毒的記載。如《名醫(yī)別錄》載錄有毒藥物131種。《新修本草》 載錄143種，將中藥毒性分為大毒、有毒和小毒3級?！蹲C類本草》 載錄223種?！侗静菥V目》載錄361種，并列有毒草專注，皆在每一 味藥物性味之下，標明“大毒”、“有毒”、“小毒”或 “無毒”等字樣，而對于“有毒”藥物的炮制、用量、用法及配伍禁忌更有詳釋。如砒石、升藥、輕粉等為大毒:瓜蒂、朱砂、附子等為有毒;桃仁、鴉膽子、吳柴萸等為小毒。但由于這些分類缺乏客觀依據(jù)，因此同一.藥物在不同書籍中的毒性分類并不相同。如蟾蜍、馬錢子、斑蝥，有的書中記為大毒，有的則記為有毒。2500年前的周代，人們將凡能治病的藥物統(tǒng)稱毒藥。隋●巢元方《諸病源候論》也說:“ 凡藥物云有毒及大毒者，皆能變亂，于人為害，亦能殺人”。近人劉沛然(1994)老中醫(yī)認為“細辛之量被限，實在冤枉”，為使被囚禁的藥物效能開拓出來，他親身體驗并做各種檢驗，掌握了第一手資料，破除了傳統(tǒng)的“細辛不過錢”之說。此外，他在臨床工作中思路深細，從不株守一家之言，頗能獨開生面，心得尤多，為體驗中藥性味及其作用，曾品嘗過470種中藥藥汁以驗證臨床療效。正因為有了成千上萬個像劉沛然這樣的中醫(yī)藥家深入實踐，勇于探索，不斷創(chuàng)新，在歷史文獻上才能夠記載著數(shù)千種動、植、礦物藥的性味、歸經、主治癥及配伍經驗,而可貴之處更在于記載著許多藥物的毒性，使人們趨利避害，有所遵循。
中藥毒性有廣義和狹義之分。所謂“廣義之毒”有兩個層面的含義。一是把“毒藥”作為藥物的總稱。如《周禮》云:“醫(yī)師掌醫(yī)之政令，聚毒藥以供醫(yī)事”。張子和云:“ 凡藥皆有毒也，非止大毒、小毒謂之毒”。二是指藥物的偏性。在《素問》中有這樣的記載:“大毒治病，十去其六:常毒治病，十去其七;小毒治病，十去其八;無毒治病，十去其九”。可見，在2000多年前，古人就能規(guī)范用藥制度，以最小的藥物副作用達到最佳的治療效果，即使是用沒有毒性的藥物治病，也只能用到去除病邪的十分之九就應該停藥，隨后用五谷、肉類、果品、蔬菜等飲食物進行調養(yǎng)。張景岳亦云:“藥以治病， 因毒為能，所謂毒藥，是以氣味之偏也。蓋氣味之正者，藥餌之屬也，所以去人之邪氣。....故日毒藥攻邪也”●所謂“狹義之毒”即為有毒之毒、合用之毒、無毒之毒。“有毒之毒”指本草著作中明確標明“有毒”之藥，由于用量過大或炮制方法不當?shù)仍蚨字轮卸尽！昂嫌弥尽?指某些毒性不大的藥物可因配伍不當而加劇其原有的毒性，甚至一些單用無害的藥物，也可因配伍不要而產生毒性?！盁o毒之毒” 即為未標明有毒的藥物而導致中毒;或因辨證不當，或中病不止，或用量過大而致出現(xiàn)- - 些副作用。
由于中藥具有特殊作用，且常被認為其毒副作用小，甚至無毒副作用，因此被許多老年慢性病患者長期服用。甚至有些健康人也長期服用一些中藥來預防疾病，延緩衰老，增強體質。但在臨床運用中，由于配伍不當，炮制欠佳或某些藥物劑量過大等原因，中藥中毒的事件時有發(fā)生。為避免走入“中藥無毒”的誤區(qū)，防止中藥中毒事件的發(fā)生，有必要對中藥毒性進行重新認識。中醫(yī)藥學是一門自然科學，必定會發(fā)展?！鞍l(fā)展”就必然要突破“傳統(tǒng)”。人們對毒性藥物的認識是不斷深化和發(fā)展的。所以，“毒”的含義已不是古時那樣廣義的概念。對于古代文獻曾記載其有毒的中草藥，但是通過后人的實踐而證明無毒者有之:文獻記載無毒，而臨床發(fā)現(xiàn)其有毒者亦有之。其中有代表性的是1991出版的《有毒中草藥大辭典》(天津科技翻譯出版公司),編寫內容參考古今專著80余部,現(xiàn)代論著3000余篇，全書共收錄有毒中草藥503種。我們在臨床工作中應用具有毒性的藥物時，必須加以注意，要根據(jù)病人的體質強弱和病情輕重，適當選用和確定劑量。應用有大毒的藥物，更要特別慎重，嚴格控制用藥劑量。即使未標注毒性的藥物也應嚴格按照適應證和用法、用量正確使用。
四、臨床特點及發(fā)病機理
以往國內報告的腎損害多為服藥劑量大且時間短，腎毒性反應發(fā)作急驟，呈急性中毒病程:國外則相反，為服藥劑量小且時間長，腎毒性反應發(fā)作遲緩，呈慢性中毒病程。歸納國內外報道，中草藥所致的腎損害根據(jù)給藥種類、途徑、劑量和用藥時間的不同，其臨床表現(xiàn)多種多樣，但表現(xiàn)為腎功能衰竭者為多。按病情進展快慢，可分為急性腎功能衰竭和慢性腎功能衰竭。急性腎功能衰竭(ARF)在服用中藥后較短時間內(一、二天至數(shù)周)發(fā)生，常有明顯胃腸道癥狀(如食欲不振、惡心、嘔吐)，顏面及全身浮腫，血尿,少尿甚至無尿，但也有患者無尿量減少，實驗室檢查蛋白尿、管型尿、血尿，尿素氮、血肌酐升高，離子紊亂，及時停藥并予支持對癥治療或腹膜透析?？苫謴湍I功能，但也有少數(shù)重癥者死亡。慢性腎功能衰竭(CRF)起病緩慢而隱匿，病變均呈進行性發(fā)展，經數(shù)月、數(shù)年進入腎功能衰竭期或尿毒癥期。
日前國內外研究尚未明確中草藥腎病的致病機理，多認為有以下幾種可能:①中草藥本身所含毒素直接損害腎小管上皮細胞|2,致廣泛近曲小管壞死，導致急性腎功能衰竭、尿毒癥、甚至死亡。但壞死的腎小管再生能力很強，若治療及時，?？赏耆祻?。常見的中草藥有蒼耳子、鴉膽子、白果、馬錢子、雷公藤、斑蝥、魚膽、鉛粉、商陸、木通、朱砂、澤瀉、蜂蜜、川楝子等。腎穿刺活檢顯示:服用雷公藤者鏡下可見腎小管受炎性細胞浸潤明顯，腎小管上皮明顯變性、壞死、萎縮。服關木通者表現(xiàn)為皮髓質交界部的上皮細胞大量壞死133。服魚膽者腎小球正常，腎小管上皮細胞腫脹、壞死，小管腔內有紅細胞管型[34]。②直接損害腎小球132:如蒼耳子，因含毒蛋白、蒼耳毒甙等成分能損害腎臟實質細胞[J,致使腎小球變性壞死，導致急性腎衰、尿毒癥、死亡。此類藥還有斑蝥、雷公藤、防己、牽牛子等。③中草藥毒性成分及其代謝產物通過腎臟排泄引起腎臟腎炎樣改變、腎脂肪樣變性等[321。此類藥有檳榔、防己、白頭翁、蘆薈、巴豆、牽牛子等。④中草藥引起全身性過敏反應或溶血反應132),而致急性過敏性間質性腎炎及腎功能衰竭。如海馬、獨活、水蛭、蜈蚣等引起患者溶血性反應而損害腎功能，表現(xiàn)為大量血尿。⑤引起腎缺血[32],有些中草藥中毒后引起消化道反應，由于劇烈的嘔吐、腹瀉，導致水、電解質失調，血容量下降，腎血流量減少，腎缺血缺氧而致腎小管上皮細胞壞死出現(xiàn)急性腎功損害。⑥引起間質性腎炎[321:如馬兜鈴酸腎病，病理表現(xiàn)為廣泛間質硬化、小管婁縮，以近端小管受累為主。
許多學者認為目前的研究還很不夠，或者說是非結論性的，大量的文獻報道也都未能證實腎損害和致癌的就一定是含有馬兜鈴酸的中草藥。因此本課題主要針對FDA所提到的B類藥物進行研究，即那些因為中藥藥名相似，其可能摻雜有相應的A類植物，事實上不一定含有馬兜鈴酸成分，或者它們?yōu)轳R兜鈴科植物，但現(xiàn)有的資料卻并沒有其含有馬兜鈴酸的記載。.我們在其提到的目錄中選取了三味臨床常用中藥(細辛、威靈仙、北豆根)作為研究對象，利用腎功生化檢測及組織形態(tài)學檢查手段，觀察每味中草藥水煎劑不同劑量對大鼠腎臟損傷作用的生化學及病理形態(tài)學改變特點。
第二部分實驗研究
一、中藥細辛致腎損害的實驗研究材料與方法.
1、材料.
1.1實驗動物雌性 Wistar大鼠，體重150- -190g只。黑龍江中醫(yī)藥大學試驗動物中心提供，在黑龍江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學實驗室飼養(yǎng)，實驗期間自由飲水、攝食，通風及濕度良好。實驗前動物外觀、營養(yǎng)狀態(tài)及行為均無明顯異常。
1.2中藥細辛購自 黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院第二門診中藥局，經--般性狀鑒別和顯微鑒別，鑒定為馬兜鈴科植物東北遼細辛。
1.3細辛水煎劑取細辛生藥 1000g,加12000ml水，浸泡1小.時后，加熱至沸騰后煎煮5分鐘，傾出藥液，再加入8000ml的水繼續(xù)煎煮，沸騰即淋出。再合并兩次藥液，經過濾、濃縮后制成1000ml藥液(1g生藥/ml)，4C冰箱保存?zhèn)溆谩?
1.4實驗儀器
(1)高速低溫離心機: HI mac21日本日立公(2)超薄切片機: 日本OLYMPUS公司生產。(3)光學顯微鏡:日本OLYMPUS公司生產。
(4)FEI TECNAIG2型電子顯微鏡:荷蘭飛利浦公司生產。(5)日立-7170A型自動分析儀:日本日立公司生產。(6)尿十一聯(lián)試紙:桂林市華通醫(yī)用儀器有限公司。
2、方法
2.1分組：將28只大鼠按體重隨機分成4組，分別為細辛低劑量組、細辛中劑量組、細辛高劑量組和正常對照組。每組各7只。
2.2給藥劑量：大鼠低劑量給藥組藥量為0.46g.kg'●d',中、高劑量分別按5倍、10 倍量計算。正常對照組給同體積自來水，每日一次灌胃。共給藥3個月。
2.3腎功能測定：分別于第四、 八的周末摘除大鼠眼球取血，第十二周周末斷頭采血，進行血肌酐、尿素氮的測定(自動生化分析儀) .
2.4尿標本檢測
用代謝籠接取大鼠 即時尿約1ml,進行尿蛋白、尿糖、尿潛血及尿中酮體的測定。
2.5腎組織形態(tài)學檢查
腎組織標本用 4%中性緩沖甲醛液固定，石蠟包埋，制成2um厚切片，采用HE染色，于光鏡下觀察。腎皮髓質交界處標本用3%戊二醛固定，于電鏡下觀察。
3、統(tǒng)計學處理
計量數(shù)據(jù)以均數(shù)+標準差(X+S)表示，同一實驗組不同時間點的差異及不同實驗組同- -時間點的組間差異采用1檢驗。P<0.05表示有顯著差異。尿蛋白定性數(shù)據(jù)則以一~士、+~十十表示，采用x2檢驗。
結果:
1、大鼠體重變化
見表格 1.各實驗組在飼養(yǎng)期間體重均有所增加，但細辛低、中、高劑量組與正常對照組相比無明顯差異，即P>0.05。
表1、
2、尿標本檢測
各組大鼠在實驗期間尿中的葡萄糖、潛血、酮體均為陰性，但尿中均含有少量或大量蛋白。細辛高劑量組與正常對照組相比,三個月都有顯著差異(即P<0.05)。但細辛中、低劑量組與正常對照組相比在三個月中均無明顯.差異(P>0.05)。見表格2。同一組在不同時間比較無顯著差異(P>0.05) 。
4、腎臟病理檢查結果
在實驗進行 3個月后，統(tǒng)一處死大鼠并立即留取腎臟組織。于光鏡下觀察:細辛低劑量組:組織結構普遍完好。細辛中劑量組:可見皮髓質交界處局部腎小管上皮空泡樣變性，管腔呈網(wǎng)絮狀，髓質部腎小管間質成分局部明顯增多。細辛高劑量組:皮質部可見腎小囊壁層上皮細胞有較大空泡，局部腎小管上皮也可見空泡樣變性，腎小動脈周邊有血管透明樣變性，小動脈管壁增厚，管腔縮小，腎小管腔內有蛋白管型樣結構。正常對照組:腎小球及間質組織結構完好。于電鏡下觀察:細辛低、 中、高劑量組腎小球大小正常。細辛低劑量組:腎小管上皮細胞無腫脹，基底膜光滑無增厚，未見電子致密物沉積。細辛中劑量組:腎小管.上皮細胞間腺正常，無腫脹，少數(shù)線粒體變形，部分微絨毛排列紊亂。細辛高劑量組:腎小管上皮細胞間隙增寬，少量已脫落或將要脫落入小管腔，上皮細胞普遍空泡樣變性，核形不完整，線粒體溶解變性，微絨毛稀疏脫落，部分已溶解。正常對照組:腎小球及腎小管組織結構完好。
二、中藥威靈仙致腎損害的實驗研究材料與方法
1、材料
1.1實驗動物雌性 Wistar大鼠，體重150- 190g/只。由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，在黑龍江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學實驗室飼養(yǎng)，實驗期間自由飲水、攝食，通風及濕度良好。實驗前動物外觀、營養(yǎng)狀態(tài)及行為均無明顯異常。
1.2中藥威靈仙 購自黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院第二門診中藥局，經一般性狀鑒別和顯微鑒別，鑒定為毛茛科植物威靈仙Clematis chinensis Osbeck的根。
1.3威靈仙水煎劑取威靈 仙生藥500g,加6000ml水，浸泡1小時后，加熱至沸騰后煎煮15分鐘，傾出藥液，再加入4000ml的水繼續(xù)煎煮，加熱至沸騰后10 分鐘即淋出。再合并兩次藥液,經過濾、濃縮后制成s00ml藥液(1g生藥/ml),4C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4實驗儀器
(1)高速低溫離心機: Hi mac21日本日立公司生產。(2)超薄切片機:日本OLYMPUS公司生產。
(3)光學顯微鏡:日本OLYMPUS公司生產。
(4)FEI TECNAIG2型電子顯微鏡:荷蘭飛利浦公司生產。
(5)日立一7170A 型自動分析儀:日本日立公司生產。(6)尿十-聯(lián)試紙:桂林市華通醫(yī)用儀器有限公司。2、方法
2.1分組
將28只大鼠按體重隨機分成4組，每組7只，分別為威靈仙低劑量組、威靈仙中劑量組、威靈仙高劑量組和空白對照組。
2.2給藥劑量
大鼠低劑量給藥組藥量為1.35g°kg-1●d-1，中、高劑量分別按5倍、10倍量計算。正常對照組給同體積自來水，每日一次灌胃。共給藥3個月。
2.3腎功能測定
分別于第四、八的周末摘除大鼠眼球取血，第十二周周末斷頭采血，進行血肌酐、尿素氮的測定(自動生化分析儀)。
2.4尿標本檢測
用代謝籠接取大 鼠即時尿約1ml, 進行尿蛋白、白細胞、尿糖、尿比重、PH值、尿潛血及尿中酮體的測定。
2.5腎組織形態(tài)學檢查
于第十二周周末處死所有大鼠，留取腎臟組織。腎組織標本用4%中性緩沖甲醛液固定，石蠟包埋，制成厚2um切片，采用HE染色，于光鏡下觀察。腎皮髓質交界處標本用3%成二醛固定，于電鏡下觀察。
3、統(tǒng)計學處理
計量數(shù)據(jù)以均數(shù)+標準差(x+S)表示，同一實驗組不同時間點的差異及不同實驗組同一時間點的組間差異采用t檢驗.P<0.05表示有顯著差異。尿蛋白定性數(shù)據(jù)則以-~+、十~十+表示，采用x2檢驗。
結果:
1、大鼠體重變化見表格5。各實驗組在飼養(yǎng)期間體重均有所增加，但威靈仙低、中、商劑量組與正常對照組相比無
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