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RNA修飾成學界熱點

我們并不清楚一個分子上有多少不同的修飾。但有一點很清楚,這個領域非常有意思,值得繼續(xù)深究下去。


這是一個與mRNA結(jié)合的細菌核糖體的分子模式圖。

圖片來源:Laguna Design

今天,表觀轉(zhuǎn)錄組學研究正在蓬勃開展,不過相關的技術仍不夠完善,還需要繼續(xù)開發(fā)。例如,目前技術的靈敏性尚有不足,無法對少量稀有樣本開展研究,無法對轉(zhuǎn)錄組修飾開展定量研究,并且無法通過一次試驗發(fā)現(xiàn)多種不同的修飾等。而技術上的問題早在多年前就一直困擾著研究人員。

2004年,以色列特拉維夫大學腫瘤學家 Gideon Rechavi和同事將當時能找到的所有人類基因組DNA 序列與對應的信使RNA(mRNA)進行了比對,希望找到mRNA序列里的腺嘌呤轉(zhuǎn)換成次黃嘌呤的信號。

這種轉(zhuǎn)換會改變蛋白質(zhì)的編碼序列,對人類而言,這是保證天然免疫系統(tǒng)正常功能的關鍵因素。Rechavi回憶道:“這項工作聽起來簡單,但實際上非常復雜。多個研究小組都曾嘗試過,但都以失敗告終?!敝饕驗楫敃r的測序技術還不發(fā)達,會產(chǎn)生很多錯誤的測序結(jié)果,進而帶來很大數(shù)據(jù)噪聲。

但Rechavi等人使用了新的生物信息學工具,所以成功地在轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了數(shù)千個轉(zhuǎn)換位點—— 一個有機體或細胞群中的所有mRNA,后續(xù)的研究又陸續(xù)將這些轉(zhuǎn)換位點的數(shù)量增加到了數(shù)百萬個。

不過,次黃嘌呤轉(zhuǎn)換算得上是一種特例:科研人員只需將DNA序列與RNA序列進行比對就能發(fā)現(xiàn)這些位點。但在mRNA序列里,至少有1/4 的核酸(A、C、G、U)是攜帶化學修飾物的(表觀遺傳學修飾),而現(xiàn)有的測序方法無法發(fā)現(xiàn)這些修飾物,科研人員也不知道這些修飾物會給RNA帶來何種改變。

近年來,學界掀起了一股研究RNA表觀遺傳學修飾的熱潮,很多課題組都將目光集中在 N6—甲基腺苷(m6A)這個核酸分子上,研究在全轉(zhuǎn)錄組水平上的這種化學修飾,以及該修飾與人體健康和疾病的關系。但該研究面臨的問題非常大,因為這種修飾不僅發(fā)生在mRNA分子上,也發(fā)生在其他RNA 分子上,幾乎涉及生命科學的所有領域,連病毒的RNA都會發(fā)生這種修飾。

其實這些修飾本身并不新奇。人們之所以如此關注這種修飾,是因為發(fā)現(xiàn)了與這些修飾有關的酶,并且對其有了一定的認識和理解。2010 年,美國芝加哥大學化學家何川提出,這種化學修飾反應是可逆的,而且對于基因表達調(diào)控具有非常重要的作用和意義。

不久之后,何川課題組發(fā)現(xiàn)了mRNA化學修飾去除酶——FTO。該發(fā)現(xiàn)意味著m6A不只是一個被動的修飾物,細胞也可以逆轉(zhuǎn)這種修飾反應,即mRNA的化學修飾是可以由細胞來操控的。

用抗體繪圖

早在上世紀70年代初,科學家就發(fā)現(xiàn)mRNA存在化學修飾現(xiàn)象,當時使用的技術是對m6A進行放射性標記。但因為這些實驗都是通過mRNA 3’端多聚腺嘌呤尾高選擇性技術富集mRNA分子,所以科研人員擔心這會摻雜進其他種類的RNA。

美國威爾·康奈爾醫(yī)學院化學生物學家 Samie Jaffrey表示,“正是因為這個原因,讓他們無法確定mRNA里是否還存在其他RNA以及是否發(fā)生了‘污染’,人們最終放棄了這種方案。”

另一個難題是確定mRNA里哪些位點發(fā)生了m6A修飾。傳統(tǒng)測序技術會用到逆轉(zhuǎn)錄反應,即將RNA逆轉(zhuǎn)錄成互補DNA(cDNA),然后再對cDNA 進行擴增及測序。可是這些逆轉(zhuǎn)錄酶會去除mRNA上的修飾物。對此,Jaffrey 指出,所以人們根本看不到m6A。

不過雖然存在這些技術上的障礙,科學家還是在細菌的RNA上發(fā)現(xiàn)了一些修飾現(xiàn)象,這也引起了Jaffrey 的興趣,她決定看看在哺乳動物的RNA里是否也存在這種修飾。

她和同事、遺傳學家Chris Mason一起,首先將RNA分子切成小片段,然后用含有特異性針對m6A的抗體對這些片段進行洗脫,最后對富集后含有m6A修飾物的RNA分子測序。通過這種方法,她們清楚地看到了mRNA上的修飾物,而且完全沒有污染。Rechavi課題組也通過類似方法發(fā)現(xiàn)了大量的m6A修飾位點。目前,這些名為m6A-seq和MeRIP-seq的研究方法已經(jīng)被人們廣泛采用。

多種修飾

其他RNA 化學修飾也引起了科研人員的注意。2016 年,由中國北京大學化學家伊成器、Rechavi與何川共同領導的兩個課題小組使用新抗體技術,實現(xiàn)了全轉(zhuǎn)錄組水平上N1—甲基腺苷(m1A)這一可逆RNA修飾的譜圖鑒定,發(fā)現(xiàn)m1A修飾能夠促進蛋白質(zhì)的翻譯過程。

雖然研究人員尚不清楚m1A的具體作用,但已經(jīng)找到了一條線索,即絕大多數(shù)RNA都只含有一個m1A位點,而且這些被修飾過的位點的翻譯頻率要遠遠高于其他未修飾的位點。Rechavi說:“這讓我們非常興奮,當然也是一個挑戰(zhàn),因為我們即將面對的是一套全新的mRNA翻譯調(diào)控機制。”

而其他全轉(zhuǎn)錄組化學修飾研究策略,主要利用的就是某些RNA修飾物能夠與化學標簽結(jié)合的特性。當伊成器在2011年末建立自己的實驗室時,人們已經(jīng)非常清楚,在其他RNA里含有很多修飾過的RNA組成的核酸——假尿嘧啶,但在mRNA里還沒有發(fā)現(xiàn)過這些核苷。

2015 年,伊成器實驗室發(fā)現(xiàn)了一種化學標記和洗脫方法,可用于富集mRNA上的化學修飾物。出乎預料的是,他們在人和小鼠的mRNA中發(fā)現(xiàn)了大量假尿嘧啶。于是他們開始專注于研究這些化學修飾物的功能。

伊成器認為,“mRNA里的假尿嘧啶可能具有多重功能,這取決于它們在什么時候、什么位置、如何出現(xiàn),以及是如何對RNA進行調(diào)控的?!蹦壳叭藗円舶l(fā)現(xiàn)了很多假尿嘧啶寫入因子,但還不清楚是否存在假尿嘧啶擦除因子和識別因子。

不論是抗體還是化學標記,發(fā)現(xiàn)RNA中化學修飾位置都是一項非常麻煩的工作。例如,使用抗體時會面臨交叉反應的問題,因此,科研人員必須使用兩種以上的抗體進行實驗,而且還得進行交叉驗證。而使用化學標記方法又有可能更傾向于切斷、結(jié)合和富集某些特定的RNA片段并帶來偏倚。

伊成器表示,測序深度和所使用的生物信息學軟件會影響人們發(fā)現(xiàn)RNA修飾位點的工作。此外,細胞培養(yǎng)時間也會影響RNA的修飾水平。

優(yōu)化工具

但無論何時,僅知道某個化學修飾是遠遠不夠的。芝加哥大學分子生物學家Tao Pan 指出,人們還需要對所有的RNA修飾進行定量分析,因為細胞也許就是依靠一定量的RNA修飾才能進行某種功能。對于那些希望通過激活RNA修飾相關蛋白調(diào)控修飾水平的科研人員而言,這種修飾定量信息尤為重要。

2015 年,Pan課題組提出了RNA修飾定量研究策略,至少可用于轉(zhuǎn)錄RNA(tRNA)的修飾研究。該策略采用了一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶,能以較高的效率通讀待測RNA分子,哪怕分子中有很多位點已經(jīng)發(fā)生了化學修飾,也不影響該逆轉(zhuǎn)錄酶的效率。

但最快速了解這些化學修飾物功能的方法可能就是發(fā)現(xiàn)它們的識別因子、寫入因子和擦除因子。一旦人們發(fā)現(xiàn)了能夠識別某種化學修飾物的因子,那么就可以很容易地通過基因編輯技術調(diào)控該因子的表達,從而幫助科學家在全局上發(fā)現(xiàn)化學修飾改變的跡象。

近幾年,何川課題組又發(fā)現(xiàn)RNA修飾是一種轉(zhuǎn)錄子調(diào)控機制,參與了細胞內(nèi)多種不同的作用。因此,科學家迫切需要更多、更好的新技術來探索這些奧秘。

去年10 月,美國國立衛(wèi)生研究院給何川和Pan提供了一個為期5年、總金額為1060萬美元的資助,以幫助他們建立一個新中心,用于開發(fā)與RNA修飾研究有關的新技術。

借助新影像學技術,人們有可能在肉眼下看到某個RNA分子上的修飾物。此外,科學家開發(fā)出新的RNA直接測序技術,以替代傳統(tǒng)測序方法。比如英國牛津納米孔技術公司成功將DNA納米孔測序技術拓展成RNA納米孔測序技術。

但目前仍存在其他挑戰(zhàn),例如在數(shù)據(jù)方面就有不小的困難,比如RNA修飾的絕對數(shù)量就是個問題。在一個RNA分子上找出所有的修飾,這需要對軟件進行大量嚴格的訓練,才能夠讓它們準確地識別并區(qū)分每一個修飾位點的具體情況。約翰斯·霍普金斯大學生物醫(yī)學工程師Winston Timp 說:“我們并不清楚一個分子上有多少不同的修飾。但有一點很清楚,這個領域非常有意思,值得繼續(xù)深究下去?!?strong>(張章編譯)

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